原核质粒pGEX-4T-2-PLEKHQ1及真核质粒pCMV-Myc-PLEKHQ1的构建与蛋白表达

目的:构建基因PLEKHQ1的原核质粒及真核质粒。方法:全长编码基因PLEKHQ1的聚合酶链反应(PCR)产物经Eco RⅠ和Kpn1双酶切后,分别与双酶切后的载体pGEX-4T-2及载体pCMV-Myc相连,在pGEX-4T-2-PLEKHQ1转化E.coli DH5α提取质粒后,转化E.coli BL21中诱导GST-Q1融合蛋白表达,利用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化诱导的融合蛋白;而pCMVMyc-PLEKHQ1则瞬转至293TX细胞;用蛋白质印迹法(Western blot)检测GST-Q1和Myc-Q1融合蛋白表达。结果:将获得的重组质粒进行双酶切鉴定,得到约1500 bp的目的片段,符合预计大小。质粒经测序分析正确后,Western blot检测到诱导及纯化后的GST-Q1和转染293TX后的Myc-Q1蛋白。结论:成功构建的pGEX-4T-2-PLEKHQ1和pCMV-Myc-PLEKHQ1重组质粒,为深入研究PLEKHQ1功能奠定良好的基础。

构建原核表达质粒pGEX-4T-2-GFP并鉴定其在大肠杆菌中的表达

目的:构建绿色荧光蛋白(GFP)的原核表达质粒,用以研究小鼠巨噬细胞吞噬细菌的能力。方法:编码GFP的聚合酶链反应(PCR)产物经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后,与双酶切后的载体p GEX-4T-2相连,将p GEX-4T-2-GFP转化E.coli DH5α提取质粒,经测序后转化E.coli BL21中诱导GST-GFP融合蛋白表达,将表达融合蛋白的大肠杆菌滴入培养巨噬细胞的皿中,于荧光显微镜下观察GFP的表达及大肠杆菌被吞噬情况。结果:获得的重组质粒测序正确。荧光显微镜下能清晰观察到培养基中及被巨噬细胞吞噬后发绿色荧光的大肠杆菌。结论:成功构建了pGEX-4T-2-GFP重组质粒,为研究小鼠巨噬细胞吞噬细菌的能力创造条件。

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE1基因原核表达载体。方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT- PCR扩增出MAGE1基因。酶切鉴定后,将其插入pGEM T载体,再克隆至原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达质粒pGEX4T-1MAGE-1。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h,SDS PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况。结果:RT-PCR扩增出长度为927bp的MAGE1基因。重组表达质粒pGEX4T1MAGE1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57000,占菌体总蛋白的23%。结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX4T-1MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。

脂蛋白相关磷脂酶A2表达载体的构建

为构建大鼠脂蛋白相关磷脂酶A2(LP-PLA2)原核表达载体,采用PCR方法扩增得到了大鼠LP-PLA2基因全长序列,构建了pGEX-4T-1-rLP-PLA2重组质粒。将该质粒进行DNA序列测定,结果与LP-PLA2序列一致。成功构建的LP-PLA2的原核表达载体pGEX-4T-1-rLP-PLA2可用于LP-PLA2的功能研究,为研究LP-PLA2在细胞中的功能奠定了基础。

重金属镉抗性基因czcA原核载体构建与鉴定

首先,将含有强抗镉czcA基因的重组质粒pGM-T载体进行PCR扩增和鉴定,其次,将带有双酶切位点的czcA基因与pGEX-4T-2载体构建,转化于E.coli BL21 DE3中,最后,经PCR鉴定和测序检测均表明试验成功,为下一步czcA基因片段进行诱导融合蛋白的表达提供了前提。

禽呼肠孤病毒σ_2基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株和广西分离株R 1的2σ基因。将2σ基因克隆至PGEX-4T-1载体上,测序结果表明,插入的片段为2σ目的基因。切下目的基因2σ重组到含有谷胱甘肽(G ST)的融合蛋白质原核表达载体PGEX-4T-1,获得重组质粒。经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表达2σ基因插入的位置、大小和读码框架均正确,表明成功构建了融合表达载体PGEX-S1133-2σ和PGEX-R 1-2σ。构建好的重组质粒,在大肠杆菌JM 109α中经1 mm o l/L IPTG诱导得到了表达。融合蛋白G ST-2σ和G ST R 1-2σ的相对分子质量为65 100,以包涵体形式存在。W estern-b lot分析表明,融合蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。

GRα-GST融合表达载体的构建及重组蛋白的表达

[目的]构建GRα-GST融合表达载体并获得重组蛋白,以期为筛选类糖皮质激素样中药提供工具。[方法]运用RT-PCR扩增得到包含CDS的GRα基因序列后,经T-A克隆插入PMD-18载体。以此重组载体为模板扩增含有BamH I与Xho I酶切位点的GRαORF,插入pGEX-4T-1载体后形成了重组载体,并使其在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达融合蛋白,再用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达。[结果]成功的将GRα-全基因构建入原核表达载体pGEX-4T-1中。测序结果表明载体构建成功,无插入和移码突变。经IPTG诱导后获得与预测大小(112kDa)完全一致的目的蛋白即GRα-GST融合蛋白。[结论]成功获得了含重组载体的大肠杆菌,并在IPTG诱导下较好的表达,得到了GRα-GST融合蛋白。

人TIMP-2基因的克隆及其原核表达

目的构建人TIMP-2重组表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。方法提取人肝癌细胞(Hep G2)总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,插入克隆载体pMD18-T;酶切鉴定和测序后将TIMP-2导入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-TIMP-2。将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达后用SDS-PAGE电泳检测并用western blot验证(蛋白质印迹法)。结果成功构建原核重组表达载体pGEX-TIMP-2,并在原核宿主BL21中大量表达融合蛋白GST-TIMP-2。结论克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表达。

犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建

根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。

TSLP基因的原核表达载体的构建

目的:构建TSLP基因的原核载体pGEX-4T-1/TSLP并将其转到大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,最后获得基因表达产物。方法:用PCR方法从含有TSLP全基因序列中扩增目的基因,将TSLP基因连接到pGEX-4T-1质粒上,并转到大肠杆菌BL21(DE3)中。最后检测TSLP基因。结果:经测序及PCR证实TSLP准确插入原核表达载体pGEX 4T-1中SDS-PAGE及Western blotting分析证明重组蛋白的分子量约为40KD。结论:成功构建表达了含有TSLP的原核重组载体,并在大肠杆菌中表达。

EB病毒潜伏膜蛋白2A_(1-119)重组质粒的表达及鉴定

目的:构建含EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白(LMP)2A N端1-119基因的重组质粒,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:采用RT-PCR方法从B95-8细胞中获得LMP2A1-119外显子基因片段,并克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果:pGEX/LMP2A1-119重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE结果表明表达产物相对分子质量约为50 kD,West-ern blot结果证实其为目的蛋白。结论:EBV LMP2A1-119蛋白可在pGEX-4T-1原核表达系统中表达,为进一步研究其免疫学特性打下了基础。

禽流感病毒血凝素基因在大肠杆菌中的表达

采用RT＿PCR技术扩增禽流感病毒HA1基因,将HA1结构基因克隆于pGEX＿T载体上,测序结果表明插入的片段为HA1目的基因。切下目的基因HA1,重组到含有谷胱甘肽(GST)的融合蛋白原核表达载体PGEX＿4T＿2,获得的重组质粒经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表明HA1基因插入的位置、大小和读码框架均正确。证明成功构建了融合表达载体pGEX＿HA1。构建好的重组质粒,经1mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌BL21中得到了大量表达,经过4h表达量既达到高峰。融合蛋白GST＿HA1的分子量为62KD,以包涵体形式存在。Western＿Blot分析表明,融合蛋白能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。

肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域研究

目的明确肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域。方法通过转化技术,在E.coli BL21(DE3)中诱导表达前期研究获得的表达载体pGEX-4T-1-ABCE1-55,获得GST-ABCE1-55重组融合蛋白表达,应用GST pull-down的方法验证p GEX-4T-1-ABCE1-55与β-肌动蛋白有无相互作用。结果 GST-ABCE1-55是带有GST标签的含有357个氨基酸的重组蛋白,大小约66×10~3,在GST pull-down实验中,GST-ABCE1-55并不能与β-肌动蛋白特异结合。结论肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域应位于ABCE1蛋白第358位至第600位编码氨基酸中。

人抑制素不同亚基抗原表位表达及抗体制备

目的:根据人抑制素α、βA、βB3个亚基特点,选择各亚基特定的抗原表位进行融合表达,并制备相应的多克隆抗体。方法:根据各亚基抗原表位氨基酸序列,合成其基因序列,并选用大肠杆菌偏爱密码子,插入pGEX-4T-2中作融合表达,纯化表达产物,免疫绵羊,制备抗体,测定了抗体水平。结果:经酶切鉴定,分别获得抑制素α、βA、βB与pGEX-4T-2连接的阳性重组子pGEX-INHA、pGEX-INHBA、pGEX-INHBB。其表达产物GST-INHA、GST-INHBA、GST-INHBB及纯化后融合蛋白,经考马斯亮蓝染色鉴定,大小正确。用常规免疫法免疫绵羊抗体,经ELISA检测抗体效价,结果显示,直接提取融合蛋白GST-INHA、GST-INHBA、GST-INHBB免疫绵羊抗体效价分别为:1∶64、1∶128、1∶32,纯化后的融合蛋白GST-INHA、GST-INHBA、GST-INHBB免疫绵羊抗体效价分别为:1∶32、1∶32、1∶64。结论:可在本研究所制备的抗体的基础上建立测定血清抑制素水平的免疫诊断方法。

重组血管紧张素转化酶抑制肽工程菌细胞破碎条件优化

以重组血管紧张素转化酶抑制肽（ACEIP）工程菌E.coli BL21（pGEX-4T-2-AHP）破碎率、破碎液中目的融合蛋白浓度（GST-AHP）为主要考察指标,对重组血管紧张素抑制肽工程菌破碎条件进行了优化。结果表明,其最佳工艺条件为每克湿菌体重悬于3 mL含有2 mmol/L EDTA的1×PBS缓冲液中,加溶菌酶至终浓度20 000 U/mL,室温放置30 min后超声破碎30 min,4℃10 000 r/min离心10 min取上清液。在此最佳工艺条件下破碎液中可溶性GST-AHP浓度达到1.83 g/L。

转移相关基因ABCE1编码蛋白的表达及鉴定

目的构建谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的ATP结合盒转运子E1(ABCE1)基因的原核表达载体pGEX-4T-1-ABCE1,通过转化技术,诱导GST-ABCE1重组蛋白表达。方法通过基因克隆技术构建融合ABCE1基因的原核表达载体,经酶切和测序等方法进行检测。通过转化技术,在E.coli BL21(DE3)中诱导GST-ABCE1重组融合蛋白表达。经酶切,Western blot和质谱测序等方法对该重组蛋白进行鉴定。结果 ABCE1基因片段成功插入pGEX-4T-1原核表达载体中,双酶切和测序后,经Gen Bank blast比对验证,证实ABCE1基因插入载体部位正确,碱基序列正确。凝血酶酶切检测重组蛋白GST-ABCE1得到72 000大小的特异条带,该条带可以被ABCE1抗体识别,质谱检测得到ABCE1蛋白的特异性序列,该序列评分138分(P<0.05)。结论 pGEX-4T-1-ABCE1原核表达载体质粒构建成功,并成功诱导GSTABCE1重组蛋白表达,为继续研究ABCE1在肺癌中的作用机制奠定基础。

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bpRUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入BL21中,经IPTG诱导表达后SDS-PAGE电泳鉴定。结果酶切pGEX-4T-2-RUNX3质粒获得1300bpRUNX3片段,经测序后获得的DNA序列与GenBank进行同源性比对,证实pGEX-4T-2-RUNX3构建成功。在E.coli BL21用IPTG进行诱导表达后,SDS-PAGE电泳方法证实了GST-RUNX3融合蛋白表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,其融合蛋白在大肠埃希菌表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。

人可溶型破骨细胞分化因子的克隆原核表达及活性分析

目的克隆人可溶型破骨细胞分化因子（sODF）基因，构建融合表达载体，在大肠杆菌中表达，并制备抗体。方法采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法得到人可溶型破骨细胞分化因子（ODF）编码区cDNA，克隆入原核表达载体pGEX-4T-3，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，0．1mmol／L β—D一半乳糖苷（IPTG）诱导后收集菌体蛋白，行十二烷基硫酸钠-多丙烯酰胺冻胶电泳（SDS—PAGE）。纯化蛋白，体外诱导破骨细胞分化。结果获得人sODF基因cDNA，构建原核表达载体pGEX—ODF，转化菌株可表达人GST—ODF蛋白，蛋白相对分子质量约为43000，Western分析证实为GST—sODF融合蛋白。纯化后的表达产物体外培养人外周血淋巴细胞有破骨细胞形成，象牙片上有骨吸收陷窝形成。结论成功获得人sODF基因cDNA，并在大肠杆菌中表达了人GST-ODF融合蛋白。成功表达的人sODF蛋白有诱导破骨细胞分化的活性。为该蛋白的进一步应用研究提供了依据。

重组高频干扰素的生物合成及其活性鉴定

验证通过分子信息理论预测获得的高频干扰素(HFINF)抗病毒活性。以软件InsightⅡ和CE预测获得高频干扰素基因序列,通过分子克隆技术,将高频干扰素基因克隆到pGEX-4T-2载体中,构建高效表达质粒pGEX-4T-2-HFIFN,转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中,构建高效表达菌株,通过优化培养条件,逐级扩大培养、收集菌体,裂解菌体,将表达产物通过GST柱纯化,经SDS-PAGE鉴定,获得高纯度的HFIFN。结果表明,在菌体密度OD约为0.6时,加入体积浓度为1 mmol/L的IPTG,25℃下诱导4 h可获得含量最高的可溶性表达,将纯化的高频干扰素,通过HA细胞培养,加入VSV病毒验证实验,鉴定重组高频干扰素抗病毒活性。结果表明重组高频干扰素具有抗病毒活性,分子信息理论和实践是吻合的,这为进一步研究奠定了基础。