Caspase 3在大肠杆菌E.coliBL21中表达和活性的研究

目的:研究凋亡蛋白酶Caspase 3在大肠杆菌中的表达及活性。方法:用PCR法扩增出Caspase3基因cDNA,然后插入pCMV-Myc载体,扩增后克隆至表达载体pGEX-6p,使用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导Caspase 3蛋白的表达;应用SDS-PAGE和W estern b lot法鉴定其性质。结果:经测定诱导3 h后Caspase 3活性最高。结论:可在大肠杆菌E.coliBL21中诱导表达出有活性的Caspase 3,为研究其在细胞凋亡中的作用奠定了基础。

钙调蛋白镁结合位点突变体载体的构建、表达纯化及鉴定

目的构建钙调蛋白3种镁离子结合位点突变体的质粒载体,并进行表达纯化及鉴定,为深入研究钙调蛋白的生物学功能奠定基础。方法利用钙调蛋白cDNA进行点突变,制备3种镁离子结合位点突变的cDNA。将突变后的cDNA分别插入pGEX-6P-3载体,制备钙调蛋白突变体载体质粒。质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,培养大肠杆菌,并诱导GST融合蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B珠子和PreScission蛋白酶分离纯化蛋白。结果酶切鉴定和DNA测序证实成功构建钙调蛋白突变体质粒;表达纯化得到的钙调蛋白突变体经电泳图鉴定纯度较高,浓度约1.0mg/mL。结论本研究成功构建了钙调蛋白镁结合位点突变体融合蛋白原核表达质粒,分离纯化可获得较高浓度较高纯度的钙调蛋白突变体。