转录因子CSL-GST融合蛋白表达载体的构建及其表达纯化

目的构建转录因子CSL的GST原核表达载体pGEX-6p-1-CSL,并检测其在原核生物大肠杆菌中的表达。方法通过反转录及聚合酶链反应从人胰腺癌细胞系Hpac细胞中获得编码CSL的cDNA,定向克隆至C端带GST蛋白标签序列的原核表达载体pGEX-6p-1中,原核表达的GST-CSL蛋白经Gluta-thione-Sepharose 4B和PreScission蛋白酶纯化后用凝胶迁移实验分析其活性。结果 pGEX-6p-1-CSL经原核表达及纯化后得到了纯化的CSL蛋白。结论成功构建了转录因子CSL的GST原核表达载体PGEX-6p-1-CSL。

伊氏锥虫微管结合蛋白p15基因的分子克隆与表达

根据报道的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)微管结合蛋白p15(Tb-MAPp15)基因及其3′非翻译区保守序列设计引物,采用PCR法从伊氏锥虫云南水牛株(Trypanosoma evansi stock YNB)基因组DNA中克隆得到伊氏锥虫微管结合蛋白p15(Te-MAP p15)基因。克隆片段长273bp,编码90个氨基酸,预测分子量9.0kDa。经同源性比较,所得基因与Tb-MAP p15基因同源率达到94%。抗原性分析Te-MAP p15基因表达的氨基酸序列比T.brucei微管结合蛋白p15多5个,均参与组成其中1个抗原决定簇,并且此抗原决定簇序列形成在蛋白中常作为识别位点的α螺旋。将该基因亚克隆到pGEX-6P-1原核表达载体,转化大肠杆菌E.coli RS21宿主菌,经IPTG诱导,可成功表达。重组融合蛋白大小为35kDa,与预期大小一致,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定为重组伊氏锥虫微管结合p15蛋白。

梅花鹿鹿茸S100A4融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化

我们的前期研究表明,鹿茸发生和再生都是依赖干细胞的过程。鹿茸的干细胞存在于鹿未来鹿茸发生区的骨膜中,即生茸骨膜。AP细胞表达特有的分子S100A4,推测为鹿茸发生的关键调节分子。进一步从分子水平阐述S100A4在鹿茸发生中的调节机制需要高质量S100A4的纯品。为了解决这一问题,我们针对已从梅花鹿AP细胞反转录出的S100A4基因序列,设计了含有EcoR I和BamH I酶切位点的上下游引物,并扩增出了目的片段。其后将S100A4基因片段和PGEX-6P-1载体酶切并进行了连接,转入Top10F’感受态细胞中,涂板筛选出了阳性克隆,进行了菌液PCR及双酶切鉴定,再将重组质粒转入了BL21(DE3)pLys S表达菌株进行了IPTG诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳及western blot鉴定表明融合蛋白成功表达,随后对融合蛋白进行了纯化。本研究成功地实现了鹿本身特有的S100A4基因的体外表达。

TRPV4原核表达纯化系统的构建及生物信息学分析

目的:构建非选择性阳离子通道蛋白TRPV4的原核表达纯化系统,并对其进行生物信息学分析,为与该目标蛋白相关疾病的研究和药物活性成分筛选提供技术支持。方法:将人源TRPV4基因分别克隆至pET-28a(+)、pET-32a、pET-15b、pGEX-5X-1、pEX-4T和pGEX-6p-1等6种表达载体,并利用BL21和Rossetta两种大肠杆菌表达宿主构建TRPV4原核表达系统。采用谷胱甘肽亲和层析和镍柱亲和层析法分离纯化目标蛋白。通过生物信息学技术对目标蛋白进行分析,获得其相应的理化性质和结构参数。结果:利用pGEX-6p-1载体和Rossetta构建了GST-TRPV4和GST-TRPV4-6his融合蛋白原核表达系统。诱导表达目标蛋白的IPTG浓度为0.6 mmol/L时,GSTTRPV4融合蛋白有明显表达,IPTG浓度为0.4 mmol/L时,GST-TRPV4-6his融合蛋白有明显表达,表达温度均为18℃。纯化GST-TRPV4-6his融合蛋白时,咪唑溶液在100 mmol/L或200 mmol/L时可以得到完整的GSTTRPV4-6his融合蛋白。结论:本文首次在原核表达系统中成功构建和表达纯化了人源TRPV4离子通道蛋白,并利用生物信息学分析解析了该蛋白的理化性质,为后续高纯度大量表达和进一步研究奠定了良好的基础。

狂犬病病毒N、G两种蛋白在间接ELISA方法中的应用比较

目的比较狂犬病N、G两种蛋白检测抗体效果。方法本研究先通过比较pET-32a(+)和pGEX-6P-1两种载体表达的狂犬病病毒G蛋白和N蛋白,采用碳酸盐纯化表达量高的两种蛋白,再以纯化的抗原用于检测93份免疫犬血清。结果 (1)以pGEX-6P-1为载体的N、G两种蛋白表达量较高。(2)碳酸盐包被液可以得到纯度较高的蛋白。(3)间接ELISA检测93份抗体,其中56份G蛋白高于N蛋白,37份N蛋白高于G蛋白。(4)血清样本检测结果都为阳性,表明免疫效果良好。结论针对N、G两种蛋白的抗体在动物体内出现时间不同,哪种抗体出现的早,有待于我们进一步研究。

1株抗欧洲型和美洲型PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。

结核分枝杆菌蛋白Rv2986c的生物信息学分析及原核表达

目的分析结核分枝杆菌蛋白Rv2986c的结构与功能,并进行原核表达。方法从NCBI Genbank数据库获取Rv2986c蛋白氨基酸序列,利用ExPASY ProtParam、Protscaleon expasy、TMHMM Server v.2.0以及SOPMA等软件对Rv2986c蛋白的生物学性质进行分析。用pGEX-6p-1-Rv2986c重组质粒转染大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3)中表达Rv2986c,并使用GST亲和层析柱进行纯化。结果结核分枝杆菌Rv2986c蛋白由214个氨基酸组成,分子式为C975H1707N319O266S1,等电点(pI)为11.95,属于稳定、亲水性蛋白,无跨膜区;二级结构α-螺旋(Hh)占51.40%,无规则卷曲(Cc)占35.05%。重组质粒pGEX-6p-1-Rv2986c转染DE3后表达相对分子质量约为51×10^3的重组蛋白Rv2986c,经GST亲和层析柱纯化得到单一电泳条带的目的蛋白。结论生物信息学方法预测了结核分枝杆菌Rv2986c为无跨膜区的亲水性蛋白,并得到高纯度的重组目的蛋白Rv2986c,为Rv2986c的结构与功能研究奠定了基础。