湖北白猪导入OMT/PGH基因的整合、表达和遗传

以湖北白猪为实验材料,显微注射OMT/PGH基因(绵羊启动子和猪生长激素的融合基因)于1125枚1～4细胞期的早期胚胎核内,共产仔167头,产仔率14.8%。Dot(斑点杂交)和Southern blot(印迹转膜杂交)检测,29头阳性,阳性率17.9%。通过传代进行转基因的遗传分析。G_0×G_0的配种组合,产仔63头,其中阳性20头,阳性率31.7%;G_0×非转基因猪的组合,产仔66头,其中阳性10头,阳性率15.2%。对11头G_0猪血清用放射免疫法测定的结果,其生长激素的浓度相当于对照组的2.03～6.70倍。16头G_0猪180日龄的生长速度比同窝对照提高11.8%;11头G_1猪比同窝对照提高14.8%,饲料转化率提高10%,瘦肉率有提高的趋势。

11个猪品种生长激素(pGH)基因多态性及其遗传分化研究

利用PCR和测序技术,检测了11个猪品种共65个个体的生长激素(pGH)基因全序列多态性,发现43个SNPs和1个位于内含子3的7 bp缺失片段。分析结果表明,pGH基因DNA序列不同功能区变异程度各不相同,外显子区、内含子区、5′和3′端非编码区SNPs位点各占SNPs位点总数的18.60%、74.42%、6.98%;外显子区8个SNPs位点导致4个氨基酸位点变异,外显子2是编码区的高变域;各SNPs的变异属典型的中性突变;不同品种有其独特的单倍型。分子方差分析(AMOVA)结果表明,pGH基因DNA序列品种内的变异(方差比率73.45%)大于品种间的变异(方差比率26.55%),品种间差异极显著(P<0.01),存在较明显的遗传分化;pGH基因自身进化及品种进化主要体现在内含子区,品种间的遗传分化与地理分布和基因交流有关。

藏猪生长激素基因(pGH)多态性研究

猪生长激素基因(pGH)是猪生长发育性状重要的候选基因之一。采用PCR-RFLP技术检测藏猪pGH基因+159^+734 bp片段的DraI、ApaI和MspI酶切多态性。结果显示,藏猪群体中DraI酶切全部切开,无多态;ApaI酶切具有4个等位基因,出现5种基因型,其中CC基因型(299A/432C)频率最高,为0.7857;藏猪群体MspI酶切出现3种基因型,杂合性CT基因型频率最高,为0.5089,等位基因C和T频率分别为0.5580和0.4420。经比较,藏猪pGH基因DraI酶切位点与其他猪种一样无多态性,而ApaI酶切出现了特异的432突变位点,MspI酶切等位基因分布相对均衡,表现出与其他猪种的差异。

猪生长激素(PGH)基因全序列扩增及序列分析

筛选了一对扩增PGH基因全序列的引物 ,用PCR法成功地扩增了PGH基因全序列 ,并对扩增产物进行了序列多态性分析。结果表明 ,与Vize等 1987年公布的序列存在 5 7bp的差异 ,同源性为 97.19% ;5个外显子间有 3bp的不同 ,同源性达 99.5 4 %。

转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系的建立及鉴定

本试验采用组织块贴壁法对初生仔猪的耳组织进行原代培养,成功分离出转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞,并对细胞进行形态学观察,冻存前和复苏后细胞活力检测,生长动力学分析,波形蛋白免疫组化,染色体计数以及微生物污染检测等生物学特性分析。结果表明,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,7组细胞冻存前细胞活力均在为92%以上,冻存3个月后细胞复苏活力仍在89%以上;细胞生长总趋势呈"S"型,即经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白免疫组化在成纤维细胞中呈阳性反应;染色体计数结果表明,染色体数量稳定;成纤维细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。本试验成功建立了转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系。

猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达

从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。

pGH基因全序列ApaⅠ酶切位点多态性与生产性能的相关分析

本实验利用PCR-RFLP技术分析了约克夏和长白猪pGH基因ApaⅠ酶切位点多态性及其与生产性能的关系.结果表明,在pGH基因序列中共检测到5种基因型,4种等位基因,基因型频率和等位基因频率在2个猪品种间分布差异不显著;约克夏ApaⅠ酶切多态位点中,AC基因型个体在165日龄体重和70-165日龄日增重上显著高于AA基因型个体(P<0.1);但长白猪ApaⅠ多态位点不同基因型在这两个生产性状上的差异不显著.

可控表达pGH基因转基因小鼠模型的建立与分析

旨在构建整合型可控表达猪生长激素(porcine growth hormone,pGH)基因转基因小鼠模型,通过控制GH的表达时间和表达量来减少GH过早表达产生的副作用,对于培育高饲料转化率大家畜具有重要研究意义。利用本课题组前期成功构建并在PK15细胞系中验证的整合型诱导表达pGH四环素(Tet-on)载体,通过原核显微注射方法制备转基因小鼠。以Southern blot鉴定为阳性的Founder鼠为基础扩繁培育,对转基因后代鼠3~10周龄通过饮水中添加诱导底物强力霉素(DOX)进行诱导试验;利用RT-qPCR技术检测外源基因表达水平;利用放射性免疫检测方法对小鼠血液中猪生长激素水平进行定量检测,同时称重,评估转入基因对小鼠机体表型的影响。结果表明,转基因小鼠诱导组的体重与转基因小鼠非诱导组和同窝非转基因组小鼠相比显著增大(P<0.05),血清中pGH水平显著上升(P<0.05),说明外源GH有效表达并且调节动物机体的生长。结果提示,该模型的建立有助于深入研究GH对机体发育的影响以及机体中影响GH分泌的分子机制和信号通路,促进GH在家畜生产中的应用,也为制备安全、高效的GH转基因大家畜奠定理论基础。

pGH基因在F_1代转基因金鱼中的整合及表达的分析

本实验对转基因金鱼进行分子生物学鉴定,所用实验材料转基因金鱼是采用显微注射的方法,将羊金属硫蛋白基因启动子与猪生长激素基因(pGH)重组而成的线形DNA片段导入金鱼的受精卵中,在合适的条件下培养获得的。为了鉴定外源基因在金鱼体内整合、表达和遗传的情况,我们选择了相同生长期的F_1代转基因金鱼6条和普通金鱼2条,进行总DNA的提取和纯化,用特异引物对pGH基因进行PCR扩增,结果表明:外源基因(pGH)在部分受体金鱼中得到了整合,并通过有性繁殖稳定地遗传给下一代。同时将阳性金鱼与阴性金鱼进行身长和体重等形态上的比较,初步断定:pGH基因在部分受体鱼中得到了表达,且有显著的促生长作用。

F1代转pGH、IGF-1双基因猪的阳性鉴定及其差异性表达

为了探究转pGH、IGF-1双基因猪F1代阳性率及表达差异情况,试验采用PCR、测序及荧光定量PCR检测转pGH、IGF-1双基因猪的mRNA表达水平。结果表明:53头F1代猪中17头为阳性猪,阳性率为32.08%,证实外源pGH和IGF-1基因已遗传到F1代中;1月龄到4月龄转双基因猪与非转基因猪IGF-1和pGH基因平均表达量均无显著性差异(P>0.05);5月龄转双基因猪pGH和IGF-1基因平均表达量分别是非转基因猪的1.98倍和2.00倍,存在显著差异(P<0.05);6月龄转双基因猪pGH和IGF-1基因平均表达量分别是非转基因猪的1.67倍和1.73倍(P<0.05)。说明pGH、IGF-1双基因已遗传至F1代猪中,并且能够在猪体内稳定表达。

转pGH基因猪外源基因染色体定位研究

应用地高辛标记探针对转pGH基因 (猪生长激素基因 )猪染色体进行原位杂交 ,经胶体金抗体、银增强放大系统检测外源pGH基因在染色体上的整合位点。研究表明 ,转基因阳性个体间外源基因整合位点存在差异 ,但对个体而言 ,外源基因总是集中分布于某一特定的染色体上。

含第1内含子的猪生长激素cDNA基因的构建

以 PCR方法扩增了猪生长激素 ( p GH)基因的第 1内含子 ,经测序表明 ,扩增的 p GH基因第 1内含子的序列与 Vize发表的序列存在 6个碱基的差异 ,同源性达 97.5%,说明 p GH基因第 1内含子具有多态性。此外 ,还发现此内含子存在有转录因子 ATF的结合位点。利用第 2外显子的 Hinf 位点 ,采用将 3个 DNA片段一步连接的方法 ,将扩增的第 1内含子插入到 p GHc DNA的正确位置上 ,从而构建出含第 1内含子的p GHc DNA。

不同品种猪生长激素基因的PCR-RFLPs分析

采用PCR-RFLPs技术,对香猪、上海白猪、大约克夏猪生长激素基因-119～+715区域共834bp片段的扩增产物分别用ApaI、DraI、MspI三种限制性内切酶检测酶切位点的多态性。结果显示:ApaI酶切时,三个品种的猪都产生了3种基因型(AA、BB和AB),BB基因型的频率以大约克夏猪最高,AB基因型的频率以香猪最高,三个猪种间基因型频率、等位基因频率的差异不显著(P>0.05);DraI酶切时,各品种猪均未呈现酶切位点的多态性;MspI酶切时,仅大约克夏猪表现出2种基因型(CC、CD),香猪、上海白猪未产生酶切位点多态性。结论:AB基因型的频率以香猪为最高,它可能是小型猪的有利基因型;在香猪和上海白猪中DraI和MspI酶切位点的多态性比较贫乏。

3个品种猪生长激素基因的多态性分析

采用PCRR-FLPs技术,对香猪、上海白猪、大约克夏猪生长激素基因-119～+715区域共834bp片段的扩增产物分别用ApaI、DraI、MspI3种限制性内切酶检测酶切位点的多态性。结果显示:ApaI酶切时,3个品种的猪都产生了3种基因型(AA、BB和AB),BB基因型的频率以大约克夏猪最高,AB基因型的频率以香猪最高,3个猪种间基因型频率、等位基因频率的差异不显著(P>0.05);DraI酶切时,各品种猪均未呈现酶切位点的多态性;MspI酶切时,仅大约克夏猪表现出2种基因型(CC、CD),香猪、上海白猪未产生酶切位点多态性。结论:AB基因型的频率以香猪为最高,它可能是小型猪的有利基因型;在香猪和上海白猪中DraI和MspI酶切位点的多态性比较贫乏。

His-猪生长激素融合基因在大肠杆菌中的表达与纯化

将通过PCR技术改建并去除了信号肽的猪生长激素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a(+),构建出能利用Ni-NTAAgarose柱一步纯化表达产物的重组质粒pPGH020。探讨了大肠杆菌中重组猪生长激素的最佳表达条件和纯化方法,制备并纯化了兔抗pGH抗体。SDS鄄PAGE和Westernblot的分析结果表明,26.5kD处有包括His·Taq、thrombin位点序列和pGH序列的融合蛋白特异条带。凝胶扫描估测猪生长激素的表达量占大肠杆菌胞浆蛋白的17.3%左右。

两个国外猪品种GH基因MspⅠ多态性及其与生产性状的相关分析

采用PCR-RFLP技术,比较分析了大约克夏猪和长白猪生长激素基因全序列的MspⅠ酶切位点多态性。结果显示,两个国外猪品种pGH基因全序列中均存在11个MspⅠ酶切位点;在大约克夏猪中有6种MspⅠ-RFLP带型,长白猪中有7种MspⅠ-RFLP带型,带型分布在两个猪品种中差异极显著(P<0.01)。MspⅠ-RFLP与生产性状的相关分析表明,两个国外猪品种各带型与生产性状的差异均未达到显著水平(P>0.05)。

显微注射导入生长激素基因产生转基因兔和鼠

本研究旨在建立显微注射转基因系统；获得表达人生长激素和猪生长激素基因的转基因免和鼠；探索提高动物生长性能的可能性与可行性。家兔和小鼠作超数排卵和交配处理，收集原核胚。将小鼠金属巯因启动子与人生长激素和绵羊金属巯因启动子与猪生长激素融合的基因质粒注入雄原核，观察体外和体内发育结果。用斑点杂交、ＰＣＲ技术和放射免疫检测外源基因的整合和表达情况。试验结果，胚胎回收后立即作体外培养的囊胚发育率为９０％，基因质粒注入雄原核后体外培养者为７８％，注入细胞质后培养者为３８％；基因质粒注入雄原核后作体内培养者为４１％。注入基因的原核胚，按其移植至受体的胚胎数分为４组：１０～１５、１６～２０、２１～２５和２６～３５枚，结果受体妊娠率随移植胚胎数的增加而提高，胚胎存活率（产仔率）则以２１～２５组为最高。出生仔鼠的平均基因整合率为１４．９％（７／４７），表达率为５７．１％（４／７）；检测仔兔中的基因整合率为１０．８％（４／３７），表达率为１００％（１／１）。分别获转基因鼠７只，转基因兔４只，其中获生长显著加快的转基因兔和转基因鼠各１只。本研究为获得转基因动物提出了可行的技术路线。

His-猪生长激素融合基因在Bm-N细胞和蚕体内的表达与纯化

用构建的带有His-Tag pgh融合基因的重组杆状病毒Bm-BacPAK6-pgh研究了Bm-BacPAK6- pgh在家蚕细胞(Bm-N)和蚕体内的表达,并对蚕体表达产物进行了纯化.SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒Bm-BacPAK6-pgh在Bm-N细胞、蚕体中得到了融合表达,Wemrn blot分析表明,Bm-N细胞、蚕体中表达的融合蛋白与大肠杆菌表达的猪生长激素具有相同的抗原性.Bm-BacPAK6-pgh在Bm-N细胞内的表达始于24h,而蚕体中的表达始于72h,二者的表达峰分别在96h和120h.经40%饱和度硫酸铵盐析和Ni -NTA Agarose亲和柱二步纯化可获得SDS-PAGE电泳纯的具有抗原性的重组猪生长激素融合蛋白.

猪生长激素基因研究进展

生长激素基因是一个重要的功能基因。本文主要就猪生长激素基因的序列分析、多态性位点及各多态性位点同生产性能的关系进行了阐述。

猪生长激素基因及其多态性的研究概况

就猪生长激素（PGH）基因的定位、结构、多态性研究概况作一简要地介绍，并对以后的研究方向作了展望。