转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系的建立及鉴定

本试验采用组织块贴壁法对初生仔猪的耳组织进行原代培养,成功分离出转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞,并对细胞进行形态学观察,冻存前和复苏后细胞活力检测,生长动力学分析,波形蛋白免疫组化,染色体计数以及微生物污染检测等生物学特性分析。结果表明,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,7组细胞冻存前细胞活力均在为92%以上,冻存3个月后细胞复苏活力仍在89%以上;细胞生长总趋势呈"S"型,即经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白免疫组化在成纤维细胞中呈阳性反应;染色体计数结果表明,染色体数量稳定;成纤维细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。本试验成功建立了转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系。

OMT/PGH基因导入湖北白猪后的整合与表达

以湖北白猪为实验材料,采用显微注射和猪精子做载体两种方法导入OMT/PGH基因,共产仔161头。取仔猪耳、尾组织,用斑点杂交和Southern杂文检测,判定25头整合。显微注射法的转基因效率为2.96％,精子载体法的转基因效率为4％。用放射免疫法测定外周血清,在非诱导状态下,有11头转基因猪生长激素的浓度为对照组的2.03～6.7倍,其2～5月龄的生长速度平均提高15.23％。当饲料中Zn离子的含量达到1670ppm时,转基因猪的生长速度显著加快。

pGH基因全序列ApaⅠ酶切位点多态性与生产性能的相关分析

本实验利用PCR-RFLP技术分析了约克夏和长白猪pGH基因ApaⅠ酶切位点多态性及其与生产性能的关系.结果表明,在pGH基因序列中共检测到5种基因型,4种等位基因,基因型频率和等位基因频率在2个猪品种间分布差异不显著;约克夏ApaⅠ酶切多态位点中,AC基因型个体在165日龄体重和70-165日龄日增重上显著高于AA基因型个体(P<0.1);但长白猪ApaⅠ多态位点不同基因型在这两个生产性状上的差异不显著.

可控表达pGH基因转基因小鼠模型的建立与分析

旨在构建整合型可控表达猪生长激素(porcine growth hormone,pGH)基因转基因小鼠模型,通过控制GH的表达时间和表达量来减少GH过早表达产生的副作用,对于培育高饲料转化率大家畜具有重要研究意义。利用本课题组前期成功构建并在PK15细胞系中验证的整合型诱导表达pGH四环素(Tet-on)载体,通过原核显微注射方法制备转基因小鼠。以Southern blot鉴定为阳性的Founder鼠为基础扩繁培育,对转基因后代鼠3~10周龄通过饮水中添加诱导底物强力霉素(DOX)进行诱导试验;利用RT-qPCR技术检测外源基因表达水平;利用放射性免疫检测方法对小鼠血液中猪生长激素水平进行定量检测,同时称重,评估转入基因对小鼠机体表型的影响。结果表明,转基因小鼠诱导组的体重与转基因小鼠非诱导组和同窝非转基因组小鼠相比显著增大(P<0.05),血清中pGH水平显著上升(P<0.05),说明外源GH有效表达并且调节动物机体的生长。结果提示,该模型的建立有助于深入研究GH对机体发育的影响以及机体中影响GH分泌的分子机制和信号通路,促进GH在家畜生产中的应用,也为制备安全、高效的GH转基因大家畜奠定理论基础。

pGH基因在F_1代转基因金鱼中的整合及表达的分析

本实验对转基因金鱼进行分子生物学鉴定,所用实验材料转基因金鱼是采用显微注射的方法,将羊金属硫蛋白基因启动子与猪生长激素基因(pGH)重组而成的线形DNA片段导入金鱼的受精卵中,在合适的条件下培养获得的。为了鉴定外源基因在金鱼体内整合、表达和遗传的情况,我们选择了相同生长期的F_1代转基因金鱼6条和普通金鱼2条,进行总DNA的提取和纯化,用特异引物对pGH基因进行PCR扩增,结果表明:外源基因(pGH)在部分受体金鱼中得到了整合,并通过有性繁殖稳定地遗传给下一代。同时将阳性金鱼与阴性金鱼进行身长和体重等形态上的比较,初步断定:pGH基因在部分受体鱼中得到了表达,且有显著的促生长作用。

湖北白猪导入OMT/PGH基因的整合与表达初报

一九八九年十月至十二月,以湖北白猪为实验材料,采用显微注射和猪精子做载体两种方法进行 OMT/PGH 基因导入。一九九○年春,共产仔161头。取仔猪的耳组织或尾组织,用斑点杂交和 Southern 杂交检测,判定有25头猪实现了外源基因的整合。显微注射法的转基因效率为2.96%,精子载体法的转基因效率为4%。用放射免疫法测定外周血清,在非诱导状态下,有11头转基因猪生长激素的浓度明显高于对照组,相当于对照组的2.03～6.7倍,2～5月龄的生长速度平均提高15.23%。当饲料中 Zn 离子的含量达到1670PPm 时,转基因猪的生长速度显著加快。

转pGH基因猪外源基因染色体定位研究

应用地高辛标记探针对转pGH基因 (猪生长激素基因 )猪染色体进行原位杂交 ,经胶体金抗体、银增强放大系统检测外源pGH基因在染色体上的整合位点。研究表明 ,转基因阳性个体间外源基因整合位点存在差异 ,但对个体而言 ,外源基因总是集中分布于某一特定的染色体上。

转pGH基因猪血清pGH含量的分析

用ELISA方法分别测定了 3头F0 代成年阳性猪和 8头F1代幼年阳性猪血清pGH的水平 ,发现阳性个体间在激素含量及变化趋势上有很大差别 ,其中F1代个体pGH变化趋势与阴性对照较为一致。研究结果表明阳性个体本身性别及生理状况与外源基因表达有关 。

转OMT/PGH基因猪的核型与G—显带的研究

对转OMT/PGH基因猪5头,按常规方法,采血制染色体标本,进行核型和G—显带分析。结果表明,转基因猪染色体数目、核型、相对长度、臂比指数与普通猪基本一致,G带带型与普通猪也无明显差异。

11个猪品种生长激素(pGH)基因多态性及其遗传分化研究

利用PCR和测序技术,检测了11个猪品种共65个个体的生长激素(pGH)基因全序列多态性,发现43个SNPs和1个位于内含子3的7 bp缺失片段。分析结果表明,pGH基因DNA序列不同功能区变异程度各不相同,外显子区、内含子区、5′和3′端非编码区SNPs位点各占SNPs位点总数的18.60%、74.42%、6.98%;外显子区8个SNPs位点导致4个氨基酸位点变异,外显子2是编码区的高变域;各SNPs的变异属典型的中性突变;不同品种有其独特的单倍型。分子方差分析(AMOVA)结果表明,pGH基因DNA序列品种内的变异(方差比率73.45%)大于品种间的变异(方差比率26.55%),品种间差异极显著(P<0.01),存在较明显的遗传分化;pGH基因自身进化及品种进化主要体现在内含子区,品种间的遗传分化与地理分布和基因交流有关。

藏猪生长激素基因(pGH)多态性研究

猪生长激素基因(pGH)是猪生长发育性状重要的候选基因之一。采用PCR-RFLP技术检测藏猪pGH基因+159^+734 bp片段的DraI、ApaI和MspI酶切多态性。结果显示,藏猪群体中DraI酶切全部切开,无多态;ApaI酶切具有4个等位基因,出现5种基因型,其中CC基因型(299A/432C)频率最高,为0.7857;藏猪群体MspI酶切出现3种基因型,杂合性CT基因型频率最高,为0.5089,等位基因C和T频率分别为0.5580和0.4420。经比较,藏猪pGH基因DraI酶切位点与其他猪种一样无多态性,而ApaI酶切出现了特异的432突变位点,MspI酶切等位基因分布相对均衡,表现出与其他猪种的差异。

F1代转pGH、IGF-1双基因猪的阳性鉴定及其差异性表达

为了探究转pGH、IGF-1双基因猪F1代阳性率及表达差异情况,试验采用PCR、测序及荧光定量PCR检测转pGH、IGF-1双基因猪的mRNA表达水平。结果表明:53头F1代猪中17头为阳性猪,阳性率为32.08%,证实外源pGH和IGF-1基因已遗传到F1代中;1月龄到4月龄转双基因猪与非转基因猪IGF-1和pGH基因平均表达量均无显著性差异(P>0.05);5月龄转双基因猪pGH和IGF-1基因平均表达量分别是非转基因猪的1.98倍和2.00倍,存在显著差异(P<0.05);6月龄转双基因猪pGH和IGF-1基因平均表达量分别是非转基因猪的1.67倍和1.73倍(P<0.05)。说明pGH、IGF-1双基因已遗传至F1代猪中,并且能够在猪体内稳定表达。

pGH和IGF-Ⅰ双基因共表达载体的构建及转双基因猪的获得与检测

旨在构建可高效表达pGH基因和IGF-I基因的双基因共表达载体，制备转双基因（pGH+IGF-I双)猪，以期探索pGH基因和IGF-I基因对猪生长发育的影响，为节粮型高痩肉率新品种猪的培育奠定理论基础。从长白猪耳样中提取总RNA，经反转录RT-PCR获得pGH基因不含终止密码子的编码序列和IGF-I基因完整的编码序列，经酶切连接克隆至pcDNA3.l(+)真核表达载体上，构建PcDNA3.l(+)-PGH-IGF-I双基因共表达载体。将其转染PK15细胞，Q-PCR检测2个目的基因在PK15细胞中的表达情况。将构建的双基因共表达载体用纳米材料包裹后转染长白猪精子，采用精子载体法制备转双基因猪。PCR及测序鉴定转双基因阳性个体，Q-PCR检测2个目的基因在转双基因猪体内的表达情况。PCR及测序鉴定追踪检测转双基因猪体内pGH和IGF-I基因的稳定情况。RT-PCR及测序结果表明，成功克隆了长白猪的pGH和IGF-I基因的编码序列。酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体，转染PK15细胞后，Q-PCR检测表明，pGH和IGF-I基因均在mRNA水平成功表达。母猪妊娠获得13头仔猪，经PCR及测序检测，其中4头仔猪为转双基因阳性，转双基因阳性率为30.76%。Q-PCR检测外源pGH和IGF-I基因在转双基因猪体内成功表达。1~7月龄均可检测到外源pGH和IGF-I基因，证明2个外源基因在转双基因猪体内稳定存在，并未随着生长而丢失。在转双基因公猪的精液中均能检测到2个外源基因，证明外源基因存在稳定传代的可能。

转pGH基因猪繁殖性能及外源基因的传代

为探讨外源pGH基因对转基因猪繁殖性能的影响及其在F1代中的遗传情况,对转pGH基因长白猪与普通长白猪繁殖性能的各项指标进行了测定和比较,并对转基因猪F1代仔猪进行了外源基因的检测。结果显示,除转基因母猪F1代仔猪断奶个体质量差异显著(P<0.05)外,转pGH基因猪与非转基因猪繁殖性能其他指标均差异不显著;转基因公猪和转基因母猪F1代仔猪转基因阳性率分别为50.00%和47.83%,外源pGH基因对转基因猪的繁殖性能未产生显著影响,并可遗传给下一代。本研究为规范合理选育转pGH基因猪提供了理论依据,为进一步研究节粮型高瘦肉率转基因猪及其在实际生产中的应用奠定基础。

猪生长激素基因及其多态性的研究概况

就猪生长激素（PGH）基因的定位、结构、多态性研究概况作一简要地介绍，并对以后的研究方向作了展望。

海南恶性疟原虫分离株Pfcrt和Pfmdr1基因点突变的研究

目的分析海南省恶性疟原虫分离株氯喹抗性转运蛋白编码基因(Pfcrt)及其P-糖蛋白同系物1(Pgh1)编码基因(Pfmdr1)的点突变特征,为探讨抗性分子标记用于氯喹抗性监测提供参考。方法采用巢式PCR(nested-PCR)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法,检测Pfcrt基因编码第76位氨基酸的密码子和Pfmdr1基因编码第86、1246位氨基酸的密码子发生点突变情况。按世界卫生组织(WHO)推荐的体外微量法测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果检测的36份血样中,28份成功扩增Pfcrt基因,导致第76位氨基酸由赖氨酸(K)变为苏氨酸(T)的突变型占64.3%,混合型占14.3%,野生型占21.4%;29份成功扩增Pfmdr1基因,导致第86位氨基酸由天冬酰胺(N)变为酪氨酸(Y)的突变型占3.4%,混合型占6.9%,野生型占89.7%。未发现编码第1246位氨基酸的密码子发生点突变。体外氯喹敏感试验结果显示,72.2%(26/36)分离株存在抗性。治疗前恶性疟原虫Pfcrt76T突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性与敏感株中的差异有统计学意义(P<0.05),而Pfmdr1点突变发生率在氯喹抗性与敏感株中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论恶性疟原虫Pfcrt基因76T可以作为监测氯喹抗性的一个分子标记。

英国：为生健康婴儿进行基因筛选

英国一家医疗机构通过PGH基因筛选技术使携带囊肿性纤维化遗传基因的格林斯曲特夫妇生育出不带缺陷基因的“设计婴儿”。

转外源基因(pGH)在猪染色体上整合状况

应用地高辛标记技术,对通过睾丸注射法制备的转基因猪进行荧光原位杂交,确定外源pGH(猪生长激素)基因在染色体上的整合位点及数目。选用睾丸注射法制备的140日龄转基因长白猪6头与同期同龄非转基因猪2头进行血细胞培养及荧光原位杂交。结果显示,外源基因已整合于染色体上,但在染色体上的整合位点具有随机性,而且不同的转基因猪阳性个体外源基因在染色体上的整合位点有差异,但集中分布于1、6、8、13号染色体上;非转基因猪染色体上无杂交信号;个体杂交信号数越多,其生长速度越快。