非洲猪瘟病毒pI215L蛋白结构与功能的生物信息学分析

[目的]研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pI215L蛋白的结构与功能。[方法]从ASFV数据库(The African Swine Fever Virus Database,ASFVdb)下载29个不同ASFV毒株的pI215L基因序列,利用生物信息学工具分析不同毒株pI215L基因的同源性及遗传进化关系,预测pI215L蛋白的理化性质、二级结构、线性表位及三维空间位置。[结果]不同ASFV毒株的pI215L基因核苷酸序列同源性较高;pI215L蛋白性质不稳定,亲水性较高,二级结构主要含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规卷曲4种形式,含有1个E2泛素化结合酶结构域;共有16处肽段是潜在的线性表位;使用SWISS-MODEL对pI215L蛋白的三级结构完成同源建模,在PDB数据库中与6NYO.1(ubiquitin-conjugating enzyme E2 R2和ubiquitin)的同源性达46.06%;再使用PyMOL软件对pI215L蛋白进行构象表位预测,准确定位预测的表位三维空间位置在模型中的分布。[结论]该研究结果为解析pI215L蛋白的结构和功能以及研制ASFV疫苗和抗ASFV药物提供了参考。

非洲猪瘟病毒pI215L蛋白单克隆抗体的制备及其反应性研究

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高致病性的传染病,研究显示,抑制宿主干扰素(IFN)产生的能力与ASFV的致病力密切相关。本实验室前期的研究结果表明,ASFV pI215L蛋白能够显著抑制病毒诱导IFN的产生。为研究pI215L抑制Ι型干扰素(IFN-Ι)的机制提供物质基础,本研究构建了重组原核表达质粒pET-21a-pI215L,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后经SDS-PAGE鉴定,结果显示表达了可溶性的pI215L蛋白。进一步纯化pI215L蛋白后免疫小鼠,并经脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选,获得能够分泌pI215L蛋白单克隆抗体(MAb)的细胞株。Western blot结果显示,该MAb能够特异性识别25 ku处的外源转染过表达不同浓度的pI215L蛋白,并且能够识别感染MOI 1、MOI 10接毒剂量的ASFV编码的内源pI215L蛋白,以及感染ASFV 2 h后不同时间点表达的内源pI215L蛋白;真核表达质粒pET-21a-pI215L转染HEK293T细胞后,以及以MOI 1的ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后分别进行间接免疫荧光(IFA)检测,结果显示,使用兔源标签HA抗体以及Flag抗体为一抗染色的细胞可见绿色荧光,使用抗ASFV pI215L MAb为一抗染色的细胞可见红色荧光,表明本实验制备的MAb可用于IFA试验,识别内外源pI215L蛋白;免疫沉淀(IP)试验结果显示,纯化的MAb能够特异性结合HEK293T细胞中外源过表达的pI215L蛋白以及ASFV感染PAMs细胞中表达的内源pI215L蛋白。本研究为进一步探究pI215L的分子免疫机制以及ASFV疫苗的研制奠定基础。