利用pIRES载体构建TCR独特型重组质粒

目的利用可同时表达两个基因片段的pIRES作为载体,构建TCR独特型重组质粒,为制备诱导抗T细胞肿瘤免疫的TCR独特型DNA疫苗提供基础。方法设计引物,提取Jurkat及Molt4细胞株RNA为模板,RT-PCR法特异性扩增CDR3区,与pIRES经酶切连接后氯化钙法转化,重组质粒经酶切鉴定后测序。结果构建出3种重组质粒pIRES-Jurkat Vβ8、pIRES-Molt4 Vβ2①和pIRES-Molt4 Vβ2②,其中pIRES-Molt4 Vβ2②测序正确,可体外表达Vβ2蛋白。结论利用真核表达载体pIRES可成功构建TCR重组质粒,并有可能用于进一步克隆佐剂基因片段入pIRES的多克隆位点,提高DNA疫苗的免疫原性。

pIRES2-EGFP-gAd质粒载体构建及在大鼠肾脏的表达

背景:已有研究证实经腹腔注射基因转染肾脏是一种简便有效的实验方法。目的:构建表达球形脂联素(gAd)的pIRES2-EGFP-gAd质粒,观察其在大鼠肾脏的表达。方法:以pET/gAd质粒为模板,PCR扩增目的片段,转化大肠杆菌,用EcoRⅠBamHⅠ双酶切后,与pIRES2-EGFP荧光质粒连接,重组构建pIRES2-EGFP-gAd质粒。将构建成功的pIRES2-EGFP-gAd质粒采用脂质体介导经腹腔注射正常大鼠体内,于注射24,48,96h和7d留取肾脏标本进行冰冻切片,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在肾组织中的表达,同时采用Western bot检测肾组织绿色荧光蛋白的表达。结果与结论:重组构建的pIRES2-EGFP-gAd载体经双酶切电泳分析及DNA测序证实无碱基突变。在腹腔注射脂质体/pIRES2-EGFP-gAd转染复合物24h,即可在肾小球肾间质检测到绿色荧光,注射48h,荧光进一步增强,之后逐渐减弱,至注射7d时,荧光强度明显减弱。Western bot检测的绿色荧光蛋白的表达结果与冰冻组织切片结果一致。说明脂质体能够介导pIRES2-EGFP-gAd真核载体在大鼠肾脏表达。

重组质粒pIRES-EGFP-BCL 11B电转染幼稚T细胞的可视化研究

将BCL11B基因插入pIRES-EGFP构建重组质粒真核表达载体pIRES-EGFP-BCL11B,采用电转染法将重组质粒转入人幼稚T细胞,转染24 h后,用原子力显微镜(AFM)观察转染前后细胞的表面形态以及生物物理性质的变化。转染72 h后,用CCK-8试剂检测幼稚T细胞的增殖情况。分别对空转的幼稚T细胞组、空载体转染组(pIRES-EGFP naked plasmid)、重组载体转染组(pIRES-EGFP-BCL 11B recombinant vector)、无电转无质粒的幼稚T细胞组进行实验。结果表明,4组幼稚T细胞的体积、高度、半宽度、粗糙度、表面颗粒大小等参数发生了变化,细胞杨氏模量以及细胞硬度也呈现很大变化,CCK-8结果显示,重组质粒pIRES-EGFP-BCL11B电转染人幼稚T细胞后影响细胞的增殖。

小鼠白细胞介素18基因克隆、测序及重组质粒pIRES-IL18-B7.1的构建

目的 :克隆小鼠白细胞介素 1 8( m IL- 1 8)编码区的 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用逆转录多聚酶链反应 ( RT- PCR)法 ,以小鼠脾细胞 m RNA为模板 ,扩增获得全长 m IL-1 8,与 p MD1 8T连接作全自动测序 ,并利用基因重组技术构建包含 m IL- 1 8和 B7.1的双基因表达质粒 p IRES- IL1 8- B7.1。结果 :经测序证实获得的 m IL- 1 8序列与文献报道完全一致 ,并成功构建了表达质粒。结论 :成功克隆了 m IL- 1 8的 c DNA,并构建了双基因表达载体 p IRES- IL1 8- B7.

狂犬病病毒CVS株G基因和IFN-α基因的克隆及双基因真核表达载体的构建

从狂犬病病毒CVS毒株致死的小鼠脑组织中提取总RNA,通过RT-PCR获得G基因;以pMD18-T-α质粒为模板,PCR扩增得到IFN-α基因。两个基因和pIRES真核表达载体分别双酶切,连接构建p IRES-G/IFN-α,经PCR、双酶切鉴定和测序证明载体构建成功。测得的G基因序列长1 575 bp,与CVS株G基因氨基酸同源性为98.5%;IFN-α序列长为570 bp,与GenBank中登录号为NM 001017411的IFN-α基因氨基酸同源性为91.6%。

小鼠白介素18与白介素1β转化酶共表达载体的构建及真核表达

为了制备白介素18前体(proIL-18)和白介素1β转化酶(ICE)共表达肿瘤疫苗,从小鼠脾细胞克隆proIL-18和ICE基因,构建小鼠proIL-18和ICE共表达质粒(pIRES-proIL-18-ICE),经测序证实序列正确后,脂质体法转染小鼠淋巴细胞白血病细胞系L1210,筛选稳定表达细胞株。转染细胞RT-PCR及转染细胞培养上清IL-18ELISA检测结果表明,肿瘤细胞可以表达并分泌成熟的IL-18。培养上清的IL-18可显著诱导ConA刺激的小鼠脾细胞产生IFN-γ,表明其具有功能活性。生长曲线和细胞周期实验证实与未转染的肿瘤细胞相比,转染空载体pIRES、pIRES-proIL-18、pIRES-ICE、pIRES-proIL-18-ICE基因对肿瘤细胞生长增殖无明显影响。IL-18白血病瘤苗的成功制备表明,利用pIRES载体在同一肿瘤细胞中共表达的proIL-18和ICE能够完全模拟生理过程,在真核细胞内有效酶切,分泌出成熟并有功能活性的IL-18;构建的IL-18瘤苗为进一步评价其在小鼠体内的抗白血病效果奠定基础。

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。

突变型人PRKAG2基因的克隆及其真核表达载体构建

目的构建含有突变位点R302Q的PRKAG2的真核表达载体。方法首先通过RT-PCR获得人PRKAG2的基因序列,然后采用PCR定点突变获得含有R302Q的PRKAG2基因序列,最后通过酶切连接至真核表达载体pIRES2-EGFP中。结果通过RT-PCR获得的人PRKAG2的编码区序列1710 bp,经测序比对与NCBI公布的序列完全一致,通过PCR定点突变拼接900 bp和800 bp片段获得了含有R302Q突变位点的PRKAG2,酶切连接至pIRES2-EGFP载体中,经菌落PCR筛选和酶切验证获得阳性克隆pR302Q-IRES2-EGFP,经测序验证与预期完全一致。结论构建含定点突变人PRKAG2基因重组载体pR302Q-IRES-EGFP为进一步研究基因PRKAG2 R302Q突变体的功能奠定了基础。

携带绿色荧光报告基因EBV-LMP2A真核表达载体构建及转染鼻咽癌细胞

目的构建携带绿色荧光基因的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A,并转染至鼻咽癌CNE2细胞。方法从EB病毒阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8中克隆EB病毒编码的EBV潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)序列,并定向克隆入p IRES2-Zs-Green1载体,双酶切及测序鉴定重组的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A;通过脂质体转染将重组的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A转染至鼻咽癌CNE2细胞(实验组),同时另设转染p IRES2-Zs-Green1载体的阴性对照组及未转染的空白对照组。利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达计算细胞转染效率,RT-PCR检测目的基因LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达。结果双酶切及测序鉴定证实真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A构建成功,荧光显微镜下发现实验组和阴性对照组细胞均发出绿色荧光,实验组细胞转染率约为75%;RT-PCR检测发现实验组细胞中有目的基因LMP2A表达,但阴性对照组和空白对照组均未检测到目的基因表达。结论成功构建了p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体并转染鼻咽癌CNE2细胞,目的基因LMP2A可在转染的鼻咽癌CNE2细胞中稳定表达。

应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系

[目的]探索应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系的筛选方法。[方法]EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接构建目的基因p IRES2-EGFP表达载体并测序确定,Lipofectamine3000转染Hela细胞分为Mock组(未转染组)、NC组(p IRES2-EGFP空载对照组)、重组质粒转染组,转染后24 h消化细胞进行初步筛选(900μg/m LG418),转染后14~16 d将长至肉眼可见的细胞克隆全部重新消化进行二次筛选(方法同初步筛选),转染后28~32 d挑选3个肉眼可见的细胞克隆,实时荧光定量PCR和WB检测目的基因过表达效率。[结果]双酶切及测序确定重组质粒成功构建,与Mock组相比,NC组无明显变化,重组质粒转染组各克隆目的基因mRNA水平分别升高109±8. 3、127±10. 5、122±9. 1倍,P <0. 01,蛋白水平分别升高33±3. 3、45±4. 7、47±4. 9倍,P <0. 01。[结论]该筛选方法 28~32d左右可快速建立Hela细胞稳转细胞系,过表达效率高,可直接进行后续实验。

hCGβ-TT-IRES-CD40L真核表达载体的构建

目的:构建含有分子佐剂CD40L的真核表达质粒hCGβ-TT,以提高hCGβ的免疫原性。方法:用分段PCR的方法构建了hCGβ-TT,然后插入双元真核表达质粒IRES的A位点,将CD40L插入pIRES的B位点构建hCGβ-TT-IRES-CD40L。结果:经测序所克隆的基因hCGβ-TT和CD40L序列正确。结论:利用分子佐剂CD40L与hCGβ-TT的连接,构建了hCGβ-TT-IRES-CD40L真核细胞表达质粒,为检测hCGβDNA免疫避孕疫苗的免疫原性及抗生育作用奠定了基础。