血管内皮生长因子165/骨形态发生蛋白改善缺氧复氧状态下成骨细胞损伤

背景:研究发现,血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白两种因子在缺氧复氧过程中相互作用,通过调节细胞内信号通路的活化,参与骨细胞损伤的修复过程。目的:进一步探究血管内皮生长因子165/骨形态发生蛋白与缺氧复氧成骨细胞损伤的关系分析。方法:取成骨细胞,建立缺氧复氧损伤模型,建模前后Real-Time PCR法和免疫印迹法检测血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白2的mRNA及蛋白表达。分别给予建模后成骨细胞不同质量浓度(10,20,40ng/mL)血管内皮生长因子165或骨形态发生蛋白2处理12,24,36,48,72 h,CCK-8法检测细胞增殖,DAPI检测细胞凋亡。结果与结论:(1)与建模前相比,建模后成骨细胞中血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白2的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05);(2)成骨细胞增殖率随着血管内皮生长因子165质量浓度的升高而明显升高(P<0.05);成骨细胞凋亡率随着血管内皮生长因子165质量浓度的升高而明显降低(P<0.05);(3)成骨细胞增殖率随着骨形态发生蛋白2质量浓度的升高而明显升高(P<0.05);成骨细胞凋亡率随着骨形态发生蛋白质量浓度的升高而明显降低(P<0.05);(4)结果表明,血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白在缺氧复氧成骨细胞损伤中低表达,给予血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白处理后缺氧复氧成骨细胞损伤明显降低,且呈浓度依赖性,提示血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白对缺氧复氧成骨细胞损伤有明显保护作用。

血管内皮生长因子复合骨形态发生蛋白-2转染骨髓间充质干细胞修复兔股骨头坏死模型

目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）联合骨形态发生蛋白（BMP-2）基因转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）在治疗兔非创伤性股骨头缺血性坏死（ANFH）中的作用.方法：分离、培养兔BMSCs,采用电转法分别转染重组表达载体pcDNA3.1-BMP-2质粒和重组表达载体pcDNA3.1-VEGF质粒,分为4组,空白组、VEGF组、BMP-2组、混合培养组.免疫蛋白印迹检测各组BMSCs的BMP-2和VEGF蛋白的表达.检测各组碱性磷酸酶（ALP）活性和钙的含量.将64只新西兰大白兔制作ANFH模型,然后随机分为4组,分别转染上述4组质粒,减压后植入ANFH模型,收集股骨头标本分别做X线检查、股骨头组织H-E染色检查.结果：体外实验显示,ALP活性和钙含量,空白组＜VEGF转染组＜BMP-2转染组＜混合转染组.体内实验结果显示第4、8周X线和组织学观察,VEGF和BMP-2真核表达载体联合转染BMSCs组股骨头修复效果优于其他3组.结论：VEGF和BMP-2均能提高BMSCs体外培养中ALP的含量和促进体外培养时BMSCs向骨细胞转化.VEGF复合BMP-2转染BMSCs可增强骨坏死区骨修复和血运重建能力.

血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白-2在糖尿病病人骨组织内表达水平的研究

目的探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)在糖尿病病人胫骨组织内的表达水平。方法在胫骨高位截骨术中,分别获取糖尿病病人(8例)和非糖尿病病人(8例)术部骨组织,从骨组织中提取总蛋白及RNA,用Western blot、RT-PCR检测骨组织中VEGF、BMP-2的表达水平。结果糖尿病病人骨组织中VEGF、BMP-2蛋白和mRNA表达水平均明显低于非糖尿病病人。结论糖尿病病人骨组织中VEGF、BMP-2因子表达低于正常水平,VEGF、BMP-2因子可能是影响糖尿病病人骨质及骨愈合的重要因素之一。

慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子,利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具有重要意义。目的:探讨慢病毒介导人BMP-2和人VEGF-165双基因转染(2次转染)骨髓间充质干细胞的可行性以及转染后细胞的诱导成骨性能。方法:将骨髓间充质干细胞分为4组:(1)未转染组;(2)空载组:通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞;(3)BMP-2组:转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP);(4)BMP-2/VEGF-165组:通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP,Lv-VEGH-165/RFP)。转染后不同时间点Western Blot检测目的蛋白表达,MTT法检测各组细胞增殖活性,转染后14 d检测各组细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论:(1)空载组、BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组在荧光显微镜下均可见相应的绿色及红色荧光蛋白表达;(2)转染后3 d,BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组均有相应目的蛋白高表达;转染后7,14,21 d,目的蛋白检测无明显变化(P>0.05);(3)BMP-2/VEGF-165组增殖稍快于BMP-2组(P<0.05),BMP-2组明显快于未转染组、空载组(P<0.05);(4)BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶活力明显高于未转染组、空载组;(5)结果表明,慢病毒介导的h BMP-2和h VEGF-165双基因经2次转染成功转入兔骨髓间充质干细胞内,并长期稳定表达,该双因子的表达能通过刺激细胞碱性磷酸酶生成促使细胞更好的向成骨细胞分化。

慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死

背景:骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165均在骨修复过程中扮演着重要角色。利用慢病毒介导这2种基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗骨损伤具有重要意义。目的:观察慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165基因共转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死的效果,以此来探讨双基因在未来骨损伤修复过程中的可行性。方法:采用液氮冰冻联合髓芯减压方法制备股骨头坏死模型,将造模成功的实验兔分为3组(n=12):(1)未转染组:植入骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨;(2)单基因转染组:植入骨形态发生蛋白2转染的骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨;(3)双基因转染组:植入骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165共转染的骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨。术后3,6,9周各组分别处死4只兔子,Westernblot检测股骨头内骨形态发生蛋白2蛋白的表达量;苏木精-伊红染色观察股骨头坏死修复情况。实验方案经桂林医学院动物实验伦理委员会批准。结果与结论:(1)术后3,6,9周各组均有骨形态发生蛋白2阳性表达,单基因转染组、双基因转染组表达量均高于未转染组(P<0.05),且呈递增趋势;术后3周,单基因转染组、双基因转染组骨形态发生蛋白2表达差异无显著性意义(P>0.05);术后第6,9周,双基因转染组骨形态发生蛋白2表达量明显高于单基因转染组(P<0.05);(2)术后9周,双基因转染组新生骨痂可填满股骨头缺损处,未转染组、单基因转染组虽有骨痂形成,但均未填满缺损处;苏木精-伊红染色示未转染组有初级骨小梁形成,但骨细胞坏死较多,骨小梁较少;单基因转染组有大量骨小梁形成,形态较好,仅有部分中断,仍不及正常骨组织;双基因转染组形成大量成熟致密骨小梁,形态与正常骨组织无明显差异;(3)结果表明,慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因共转染兔骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗股骨头坏死的效果优于骨形态发生蛋白2单基因转染形式,且目的蛋白能在体内长期有效表达。

健脾生血中药联合鹿瓜多肽注射液治疗创伤性胫腓骨骨折疗效及对骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子的影响

目的观察健脾生血中药联合鹿瓜多肽注射液治疗创伤性胫腓骨骨折疗效及对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法将110例创伤性胫腓骨骨折患者随机分为2组,对照组55例给予阿法骨化醇治疗,观察组55例在此基础上加用健脾生血中药联合鹿瓜多肽注射液治疗,2组治疗时间均为28 d。观察2组临床症状消失时间、骨折愈合时间及治疗前后中医证候积分、VAS评分、X射线骨痂评分、BMP-2及VEGF水平变化情况,统计2组近期疗效。结果观察组临床症状消失时间和骨折愈合时间均显著短于对照组(P均<0.05);2组治疗后中医证候积分和VAS评分均显著降低(P均<0.05),X射线骨痂评分、BMP-2及VEGF水平均显著提高(P均<0.05),且观察组以上指标均显著优于对照组(P均<0.05);观察组治疗总有效率显著高于对照组(P<0.05)。结论健脾生血中药联合鹿瓜多肽注射液治疗创伤性胫腓骨骨折可有效缓解症状体征,缩短骨折愈合所需时间,并有助于上调BMP-2和VEGF水平。

骨形态发生蛋白-2促进胚胎成骨细胞血管皮内生长因子表达的剂量依赖性效应

目的通过不同剂量重组人骨形态发生蛋白-2(recomb inant hum an bone morphogenetic prote in-2,rhBMP-2)刺激原代培养小鼠胚胎成骨细胞,探讨BMP-2对成骨细胞血管内皮生长因子(vascu lar endothelialgrowth factor,VEGF)表达的影响。方法取19天胎龄小鼠胚胎颅骨成骨细胞进行体外培养,采用RT-PCR、W estern b lot和免疫组化法分别检测不同浓度rhBMP-2对成骨细胞VEGF mRNA及蛋白表达的影响。结果经RT-PCR、W estern b lot及免疫组化法检测表明,VEGF mRNA及蛋白在原代成骨细胞内稳定表达;半定量分析证实,不同rhBMP-2剂量组间VEGF mRNA的表达量呈一定变化规律,随着rhBMP-2浓度的升高,VEGFmRNA的表达量逐渐增加,当rhBMP-2剂量为300ng/m l左右时,VEGF mRNA的表达量最高,超过此剂量,VEGF的表达则有下降趋势。结论VEGF可在原代鼠胚成骨细胞内稳定表达;rhBMP-2可促进VEGF在成骨细胞的表达,并呈一定的剂量依赖性关系,rhBMP-2剂量为300ng/m l左右时,其促进作用最佳。

骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力

背景:应用骨形态发生蛋白2(BMP2)和血管内皮生长因子165(VEGF165)双基因转染骨髓基质干细胞诱导成骨,为组织工程骨的研究提供实验基础。目的:探讨BMP2和VEGF165双基因转染大鼠骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力。方法:4周龄SD大鼠4只,取股骨、胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,取第3代骨髓基质干细胞分为5组,分别为未转染组、空载质粒组、BMP2单基因转染组、VEGF165单基因转染组、BMP2和VEGF165双基因共转染组,转染后48 h通过Western Blot检测BMP2和VEGF165蛋白表达变化,转染后7d检测各组细胞的碱性磷酸酶活性。结果与结论:(1)BMP2和VEGF165双基因共转染组和BMP2单基因转染组中有大量的BMP2分泌。BMP2和VEGF165双基因共转染组和VEGF165单基因转染组中有大量的VEGF165分泌。双基因共转染组中BMP2和VEGF165蛋白水平与单基因转染组比较,差异有显著性意义(P<0.05);(2)BMP2和VEGF165双基因共转染组中碱性磷酸酶活性最高,其次是BMP2单基因转染组,而VEGF165单基因转染组明显不如前两组,但是略高于空质粒转染组和未转染组。统计分析表明双基因共转染组与单基因转染组比较,差异有显著性意义(P<0.05);(3)结果表明,BMP2和VEGF165双基因转染促进骨髓基质干细胞异位成骨的能力更强。

骨髓基质干细胞与负载血管内皮生长因子/骨形态发生蛋白2聚乳酸-羟基乙酸共聚物/明胶纳米纤维支架的生物相容性

背景:应用骨组织工程学方法进行骨修复重建是治疗骨缺损的理想方法,负载生长因子的生物支架与种子细胞的结合是关键。目的:将大鼠骨髓基质干细胞种植于负载血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)/明胶纳米纤维支架,观察二者的生物相容性。方法:实验分为5组:空白支架组、BMP-2组、VEGF组、VEGF/BMP-2组(1.2∶1)、VEGF/BMP-2组(0.8∶1)、VEGF/BMP-2组(0.4∶1),将各组纳米纤维支架放入细胞培养孔板底部,然后将大鼠骨髓基质干细胞接种于培养孔内,扫描电镜观察细胞在各组支架上的黏附情况,CCK-8法检测细胞增殖能力,RT-PCR检测成骨分化基因RUNX-2,ALP,OCN的表达。结果与结论:(1)在扫描电镜下可见细胞与支架黏附,并进入支架内部,VEGF/BMP-2(0.4︰1)组的细胞黏附生长状态最好,细胞与支架紧密结合成为支架细胞复合体;(2)负载生长因子的纳米纤维支架上的细胞增殖及成骨分化标记物ALP、RUNX-2和OCN表达量高于空白支架组,并且VEGF/BMP-2浓度比例为0.4︰1时成骨分化标记物表达量最高;(3)结果表明,负载VEGF/BMP-2的PLGA/明胶纳米纤维支架可促进大鼠骨髓基质干细胞的黏附、增殖及成骨分化,具备良好的细胞相容性,且VEGF/BMP-2浓度比例0.4∶1为最佳比例。

血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白-2对成骨细胞群成骨作用的影响

血管发生是骨修复早期的关键环节之一,功能性微血管网的形成对骨组织再生至关重要,可促进血管内皮细胞与成骨细胞在信号通路上的相互作用,有利于后者在骨缺损区的募集和分化。

重组人骨形态发生蛋白2晚期自体骨痂成骨对血管内皮生长因子表达的影响

背景:重组人骨形态发生蛋白2和重组人骨形态发生蛋白7治疗骨缺损已经应用于多种实验动物模型。作者前期实验在兔自体髂骨与骨痂骨等长骨骨折治疗中应用,已取得满意效果。目的:验证采用骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2移植治疗骨缺损效果,并观察血管内皮生长因子对骨折愈合的影响。设计、时间及地点:随机对照实验,于2008-08/2009-01在本溪市中心医院科研实验室和中国医科大学附属二院实验动物中心完成。材料:2.0～2.5kg的成年健康日本大耳白兔20只。方法:将兔行双侧桡骨中段模拟骨折,12周后观察至明显骨痂生长随机分配实验Ⅰ组10只,实验Ⅱ组10只。在原骨折部位手术,切除骨痂备用,同时切除骨折端使之缺损1.5cm,实验Ⅰ组,左桡骨移植复合重组人骨形态发生蛋白2骨痂为为骨形态发生蛋白2骨痂组,右桡骨移植髂骨为移植自体髂骨组,实验Ⅱ组,左桡骨移植晚期自体骨痂为移植晚期自体骨痂组,右桡骨空白对照为空白对照组。主要观察指标:于术后14d取标本检测各组兔血管内皮生长因子基因mRNA表达水平的。结果:骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达水平差异无显著性意义(P>0.05);移植晚期自体骨痂组、空白对照组血管内皮生长因子未见明显表达。骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子蛋白表达及基因表达明显高于移植晚期自体骨痂组、空白对照组(P<0.05)。结论:骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2明显促进血管内皮生长因子的合成分泌,对促进骨缺损愈合有积极意义。

补肾祛寒治尪汤对胶原诱导型关节炎大鼠血管内生长因子及骨形态发生蛋白-2表达的影响

目的:观察补肾祛寒治尪汤各剂量组对胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠的治疗效果及对骨组织和滑膜组织中骨形态发生蛋白-2水平及血管内皮细胞生长因子水平的影响。方法:将74只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、甲氨蝶呤组、补肾祛寒治尪汤稀释剂量组(小剂量组)、补肾祛寒治尪汤正常剂量组(中剂量组)和补肾祛寒治尪汤浓缩剂量组(大剂量组),各给药组连续给药28天,观察大鼠的一般情况、关节炎指数积分,荧光实时定量PCR技术测量大鼠膝关节骨组织及滑膜及血管内皮细胞生长因子水平。结果:中剂量组与各组比较关节炎指数积分明显降低,骨形态发生蛋白-2表达水平明显提高,血管内皮细胞生长因子表达水平明显降低(均P<0.05)。结论:补肾祛寒治尪汤治疗胶原诱导型关节炎大鼠有较好疗效,其作用机制可能是因为减少血管内皮细胞生长因子的表达,而减少血管翳形成,减轻了对骨的破坏;同时提高了骨组织及滑膜组织中骨形态发生蛋白-2的表达,从而增强了对骨的修复,促进骨损伤愈合。

转染骨形态发生蛋白-2基因的血管内皮祖细胞的构建

目的通过克隆、构建pEGFP-BMP-2表达质粒载体,观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因在血管内皮祖细胞(EPCs)中的表达与分布。方法采用密度梯度法分离兔骨髓的单个核细胞,应用细胞荧光化学法及DAPI染细胞核法鉴定培养的细胞;BMP-2重组于pEGFP-C3中,经酶切、测序分析鉴定后,将其转染入EPCs内并筛选稳定转染细胞。结果鉴定培养的细胞为EPCs;pEGFP-C3-BMP-2表达质粒载体经双酶切鉴定、测序分析证实其构建成功;成功转染的EPCs中绿色荧光弥散分布于细胞胞质内,表明pEGFP-C3-BMP-2蛋白高表达,表达率为46%。结论分离与培养出EPCs;构建的pEGFP-C3-BMP-2表达质粒载体转染后,BMP-2蛋白高效表达于EPCs胞质中。

骨形态发生蛋白-2对兔骨髓基质细胞生物行为的影响

目的采用不同剂量骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticproteins-2,BMP-2)刺激体外培养的兔骨髓基质细胞(marrowstromalcells,MSC),观察促血管内皮细胞增生的重要递质血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在骨髓基质细胞中的表达及分布情况,预测MSC经BMP-2刺激后成骨效能与成血管效能的变化以及剂效关系。方法取兔双侧股骨MSC,采用MSC体外培养技术,分别以不同剂量BMP-2刺激细胞,并设立空白对照组。培养5d后,进行细胞形态(苏木精-伊红染色)、增殖情况(细胞记数法与MTT法)、碱性磷酸酶(改良钙钴法染色)、成骨结节(图像分析)、VEGF阳性细胞率(免疫组化染色)等项目的检测。结果不同剂量组间在碱性磷酸酶活性、矿化面积百分率、VEGF阳性细胞率3项观测指标上F值分别为29.87,65.75及54.05,P<0.01,差别具有显著意义,结合各组均值来看,BMP-2剂量为100μg/L左右时效果最佳;;在细胞记数与MTT检测上各组差别不显著,F值分别为1.73和0.17,P>0.05,差别不具有显著意义。结论应用BMP-2在促进基质细胞成骨潜能的同时,还可促进促血管内皮细胞增生的重要递质VEGF的表达,其应用剂量与效果之间存在明显相关关系。BMP-2应用剂量为100μg/L左右时。

人重组真核表达质粒pIRES-骨形态发生蛋白-血管内皮生长因子165的体外转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的观察人重组真核表达质粒pIRES-骨形态发生蛋白2（BMP2）-血管内皮生长因子165（VEGF165）的体外转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法以原代分离的兔骨髓间充质干细胞为研究对象，在脂质体的介导下将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165转染至细胞中，采用G418体外筛选稳转细胞株，且在mRNA和蛋白水平上分别检测转染效果。继续培养稳转细胞株，细胞分：空质粒pIRES组、pIRES-BMP2-VEGF165转染组以及成骨诱导剂组；采用Western blot分别检测培养7d和21d后各组细胞Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）和骨钙素（OCN）蛋白表达水平；培养14d后，采用Gomori改良钙钴法染色检测碱性磷酸酶活性；培养21d后，采用茜素红法钙质染色检测各组细胞钙化结节情况。结果与空质粒pIRES组比较，pIRES-BMP2-VEGF165质粒组细胞在mRNA和蛋白水平上均检测到骨形态发生蛋白2和VEGF165的表达；与空质粒组及成骨诱导剂组比较，重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165组细胞ColⅠ和OCN蛋白的表达水平均显著提升（ColⅠ：0．597±0．040比0．230±0．020，P=0．000；0．597±0．040比0．457±0．035，P=0．005：OCN：0．433±0．038比0．083±0．021，P=0．000；0．433±0．038比0．350±0．036，P=0．046）；碱性磷酸酶染色阳性区域占比均显著增加I（69．000±5．568）％比（18．333±3．056）％，P=0．000；（69．000±5．568）％比（43．333±5．508）％，P=0．002]，钙化结节阳性区域占比均明显增加[（37．747±3．763）％比（1．587±0．972）％，P=0．000；（37．747±3．763）％比（19．330±4．033）％，P=0．008]。结论人重组真核表达质粒pIRES-BMP2-VEGF165成功转染至兔骨髓间充质干细胞，且与成骨诱导剂比较，重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165对该细胞的成骨分化能力有更明显的促进作用。

α-硫辛酸联合神经生长因子可促进股骨骨折的愈合

背景:骨折愈合过程中,除需要适当的生物力学环境外,细胞因子的作用也日益引起重视。目的:观察神经生长因子联合α-硫辛酸治疗对大鼠股骨骨折愈合的影响。方法:建立SD大鼠股骨骨折模型,将72只大鼠随机分为3组:对照组肌肉注射生理盐水;神经生长因子治疗组肌肉注射神经生长因子200 ng/kg,1次/d;联合治疗组肌肉注射神经生长因子200 ng/kg,口服α-硫辛酸25 mg/kg,1次/d。给药后1,2,3周测量骨痂体积,ELISA检测血清骨形态发生蛋白2水平,Western blot检测骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白的表达,半定量RT-PCR检测血管内皮生长因子m RNA的表达。结果与结论:(1)给药后1周,3组间骨痂量无明显差异,神经生长因子治疗组和联合治疗组血清骨形态发生蛋白2水平、骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白表达、血管内皮生长因子m RNA表达均明显高于对照组(P<0.05),但两组间差异无显著性意义;(2)给药后2周,神经生长因子治疗组和联合治疗组骨痂量、血清骨形态发生蛋白2水平、骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白表达、血管内皮生长因子mR NA水平均明显高于对照组(P<0.05),而且联合组高于神经生长因子治疗组(P<0.05);(3)给药后3周,神经生长因子治疗组血清骨形态发生蛋白2水平、骨折断端骨形态发生蛋白2蛋白表达、血管内皮生长因子mRNA明显下降,但联合治疗组仍维持较高水平,明显高于神经生长因子治疗组(P<0.05);(4)结果表明,神经生长因子联合α-硫辛酸比单纯神经生长因子对大鼠股骨骨折愈合的治疗作用更明显。

腺病毒载体介导人BMP-2与VEGF-165对骨髓间充质干细胞形态特征及增殖能力影响的实验研究

目的探讨携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)与血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)双基因的腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后对细胞形态特征及增殖能力的影响。方法选取4只新西兰大白兔抽取骨髓液,分离鉴定获得第3代BMSCs做为实验对象,实验分成4组:Ad-BMP-2-VEGF-165转染组(A组);Ad-BMP-2转染组(B组);AdVEGF-165转染组(C组);BMSCs对照组(D组),每组6个复孔,连测3次。首先,将腺病毒载体转染BMSCs,获得最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI);其次,转染后1-3d观察转染各组细胞与D组形态和贴壁状况差异变化;再次,ELISA法检测转染各组目的蛋白表达量与D组的差异;最后,MTT法测定1-7d各组细胞增殖曲线,并进行组间比较。结果 BMSCs分离鉴定成功,第3代细胞高表达CD29(99.82%),CD44(94.14%)抗原。腺病毒转染组最佳MOI值分别为A组MOI=80,B组MOI=80,C组MOI=100。腺病毒转染后各组细胞形态和贴壁特性未见明显改变,边界清晰,细胞呈梭形,细胞核较大呈圆形或椭圆形,生长旺盛。转染组细胞高表达目的蛋白,在第5d目的蛋白浓度到高峰,A组BMP-2浓度为1525.47±58.16pg/ml,B组为1506.48±92.65pg/ml;A组VEGF-165浓度为1732.14±126.25pg/ml,C组为1733.59±127.07pg/ml,转染组在不同时间点的目的蛋白表达量与D组差异均具有统计学意义(P<0.05)。MTT法显示第1d、第2dBMSCs未见明显增长,第3d开始呈指数增长,第5d达高峰;第3d,A组、B组吸光度(optical density,OD)值分别为0.113±0.004、0.112±0.003,均高于C组、D组(P<0.05);第4d,A、B、C各组OD值分别为0.113±0.004、0.110±0.003、0.105±0.001,均高于D组0.102±0.004,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP-2与VEGF-165对BMSCs形态和贴壁性无明显影响,但是均可以促进BMSCs增殖,且两者对细胞的增殖无明显叠加作用。

骨形态发生蛋白-2与血管内皮生长因子双基因质粒转染鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 利用骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、血管内皮生长因子（VEGF）基因构建双基因质粒,转染鼠骨髓间充质干细胞,通过基因表达,促进成骨、成血管能力.方法 构建BMP-2、VEGF基因及双基因质粒,分离培养鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,进行质粒转染,在激发波长488 nm、发射波长507 nm荧光显微镜下观察并计算转染率,分别于1、4、7、10、15、21 d采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测转染了各组质粒的BMSCs培养液中BMP-2、VEGF蛋白的表达.结果 转染结果显示,BMP-2组为38.2％,VEGF组为40.1％、双基因质粒组为37.2％.结果显示各组均有目的蛋白的分泌,BMSCs及空载体组在BMP-2、VEGF的表达上差异无统计学意义（P＞0.05）,其余各组释放量比较差异有统计学意义（P＜0.05）,双基因质粒组的两种蛋白分泌量大于其他各组.结论 双基因质粒的表达可以互相促进,起到级联放大作用.

骨形态发生蛋白-2对原代鼠胚成骨细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的通过不同剂量重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)刺激原代培养的小鼠胚胎成骨细胞,探讨BMP-2对成骨细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及规律。方法取19 d胎龄的小鼠胚胎颅骨成骨细胞进行体外培养,采用RT-PCR法或Western blot法染色法检测不同浓度rhBMP-2、不同作用时间下对成骨细胞VEGF mRNA表达的影响及规律。结果RT-PCR法检测到VEGF mRNA在原代成骨细胞内稳定表达；半定量分析表明,随着rhBMP-2浓度的升高,VEGF mRNA的表达量逐渐增加,当rhBMP-2浓度为300 ng/mL左右时,VEGF mRNA的表达量最高,超过此浓度,VEGF的表达则有下降趋势；应用终浓度rhBMP-2(300 ng/mL)刺激成骨细胞时,不同作用时间下VEGF mRNA的表达量呈双时相,分别在3 h和24 h时出现高峰,48 h时VEGF mRNA的表达仍保持较高水平。除去各自对照组的影响,各时间点VEGF表达的相对值[(rhBMP-2组/对照组)比值]亦呈时间依赖性关系,6 h时明显升高为对照组的2．5倍(P＜0．05),36 h时约升高为对照组的2倍。结论VEGF可在原代鼠胚成骨细胞内稳定表达；rhBMP-2在体外可刺激原代骨细胞VEGF的表达,并呈一定的浓度和时间依赖性关系。