plRES-CRT／E2-SLC真核表达质粒的构建、表达的实验研究

目的：为研究针对18型人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）的高效治疗性基因疫苗，我们将钙网蛋白（Calreticulin，CRT）基因HPVl8 E2融合，并联合次级淋巴组织趋化因子（Secondary Lymphoid-tissue Chemokine，SLC），构建了作为HPV DNA基因疫苗的重组基因pIRES-CRT／E2-SLC，检测分析其在真核细胞中的表达。方法：以pDsRed2-N1-SLC为模板，利用PCR技术获得SLC基因片断，插入到pIRES载体的多克隆位点B中；以pCDNA3-CRT和HPVl8 genome DNA为模板，利用PCR技术分别获得CRT和HPVl8 E2基因片断，将CRT和E2插入到pIRES-SLC载体的多克隆位点A中。获得CRT／E2融合基因联合SLC的真核双表达质粒pIRES-CRT／E2-SLC。同时构建真核表达质粒pIRES-E2、pIRES-CRT／E2等作为实验对照。使用lipo-fectamine2000转染试剂将上述重组质粒转染人脐静脉内皮细胞株ECV，RT-PCR及Western Blot方法鉴定目的基因的表达。结果：获得阳性重组表达质粒pIRES-CRT／E2-SLC，经酶切鉴定及核酸序列测定证实真核表达质粒的构建成功。RT-PCR及Western Blot证实其目的基因在真核细胞中的正确表达。结论：正确构建真核表达质粒pIRES-CRT／E2-SLC。