大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表达载体的构建及其在小鼠MSCs细胞中的表达

克隆大鼠NeuroD2基因,旨在构建p IRES2-Ac GFP1-ND2真核表达载体并检测其在小鼠MSCs中的表达。采用RTPCR技术克隆大鼠NeuroD2基因,分析该蛋白质结构、功能域、细胞定位及与其他物种同源性;构建pIRES2-AcGFP1-ND2表达载体并转染小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs);采用Real-time PCR、免疫荧光及Western blot技术检测重组质粒在小鼠MSCs中的表达。结果表明,大鼠NeuroD2基因CDS区全长1 149 bp,共编码382个氨基酸,属于b HLH家族,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,空间结构呈现近似"螺旋-环-螺旋(HLH)"结构,主要分布在细胞核,氨基酸序列与家鼠(99%)、罗猴(98%)、人(97.7%)同源性较高;Real-time PCR结果表明转染组NeuroD2基因表达量显著高于对照组(P<0.05);免疫荧光及Western blot结果显示转染组NeuroD2蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)。成功克隆大鼠NeuroD2基因并构建了pIRES2-AcGFP1-ND2真核表达载体。

GST-π表达水平与人食管鳞癌耐顺铂的关系研究

目的拟通过调控GST-π的表达水平,观察其对食管癌细胞耐药性的影响。方法构建GST-π基因的真核表达载体,转染入亲本细胞EC9706细胞后观察GST-π的过表达是否会促使食管癌细胞耐药性的产生。结果 GST-π的表达载体pIRES2-AcGFP1-GST-π转染入EC9706细胞后,RT-PCR检测GST-πmRNA表达增强,Western blotting见其蛋白表达增强,MTT实验显示该细胞针对顺铂的耐药性增强,耐药指数达2.36。结论该实验说明增加食管癌细胞内GST-π的表达会促使食管癌细胞的耐药性产生。

原癌基因c-myc真核表达载体构建及其生物学作用

目的利用基因工程技术构建携带原癌基因c-myc的真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc-c-myc重组质粒并在Hela细胞中表达。方法以构建好的表达质粒pET28a-c-myc为基础,利用PCR方法扩增c-myc基因,并加入EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点,克隆至pMD19-T Simple载体,双酶切后将其与同样经过双酶切的真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc连接,通过PCR、酶切及测序鉴定重组质粒的正确性,再将重组质粒pIRES2-AcGFPl-Nuc-c-myc转染Hela细胞,利用荧光显微镜观察GFP表达,利用MTT和免疫印迹证实c-myc蛋白表达量提高。结果经PCR和酶切鉴定与预期结果相符,测序结果与GenBank中报道的序列完全一致,成功构建了重组表达质粒。免疫印迹证实c-myc基因在Hela细胞中得到表达。MTT结果显示Hela细胞数量显著增加。结论真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc-c-myc成功构建,c-myc基因在Hela细胞中成功表达,具有生物学活性。

人类DCC基因克隆及真核表达载体构建与鉴定

目的 克隆人类DCC基因并构建其真核表达载体pIRES2-AcGFPI/DCC.方法 从正常皮肤组织中提取总RNA,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增DCC基因全长cDNA（4351bp）,克隆人pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸测序分析,再将DCC基因定向克隆人pIRES2-AcGFP1载体中构建表达载体pIRES2-AcGFP1/DCC.结果 RT-PCR扩增后的产物在约4351 bp处出现明显的特异性条带,DCC基因的cDNA片段被成功插入真核表达载体pIRES2-AcGFP1质粒的多克隆位点,经鉴定与GenBank收录的DCC cDNA序列一致.结论 DCC基因的cDNA片段被成功克隆.