pIRES2-EGFP-gAd质粒载体构建及在大鼠肾脏的表达

背景:已有研究证实经腹腔注射基因转染肾脏是一种简便有效的实验方法。目的:构建表达球形脂联素(gAd)的pIRES2-EGFP-gAd质粒,观察其在大鼠肾脏的表达。方法:以pET/gAd质粒为模板,PCR扩增目的片段,转化大肠杆菌,用EcoRⅠBamHⅠ双酶切后,与pIRES2-EGFP荧光质粒连接,重组构建pIRES2-EGFP-gAd质粒。将构建成功的pIRES2-EGFP-gAd质粒采用脂质体介导经腹腔注射正常大鼠体内,于注射24,48,96h和7d留取肾脏标本进行冰冻切片,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在肾组织中的表达,同时采用Western bot检测肾组织绿色荧光蛋白的表达。结果与结论:重组构建的pIRES2-EGFP-gAd载体经双酶切电泳分析及DNA测序证实无碱基突变。在腹腔注射脂质体/pIRES2-EGFP-gAd转染复合物24h,即可在肾小球肾间质检测到绿色荧光,注射48h,荧光进一步增强,之后逐渐减弱,至注射7d时,荧光强度明显减弱。Western bot检测的绿色荧光蛋白的表达结果与冰冻组织切片结果一致。说明脂质体能够介导pIRES2-EGFP-gAd真核载体在大鼠肾脏表达。

真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL,pIRES2-EGFP/CD的构建和鉴定

目的构建真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL和pIRES2-EGFP/CD,为研究其联合表达对恶性胶质瘤的联合治疗作用提供基础。方法将pCMV/CD质粒和pcDNA3.1(+)/TRAIL质粒行琼脂糖凝胶电泳检测,确定其完整性,并进行序列测定确定有无基因突变。pCMV/CD质粒用SacⅡ/XhoⅠ双酶切,pcDNA3.1(+)TRAIL质粒用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,将目的基因定向克隆到真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,转化E.coli DH5α感受态细胞,通过限制性内切酶双酶切、PCR及核酸序列分析等筛选、鉴定重组质粒。结果所构建的真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL经SacⅡ/XhoⅠ双酶切回收片段分别为1.0、5.2 kb;pIRES2-EGFP/CD经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切回收片段分别为1.3、5.2 kb。PCR及测序证实,pIRES2-EGFP/TRAIL和pIRES2-EGFP/CD质粒基因组中分别包含TRAIL和CD基因。结论成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL和pIRES2-EGFP/CD,为研究其联合表达对恶性胶质瘤的联合治疗作用奠定了基础。

pIRES2-EGFP-MyoG真核表达载体的构建和鉴定

为了构建能够表达日本和牛生肌素(myogenin,MyoG)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP-MyoG,试验从日本和牛成纤维细胞基因组中扩增出MyoG基因,插到带有EGFP和内部核糖体转入位点(IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,经酶切鉴定正确后转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,用RT-PCR和Western-blot检测MyoG基因的表达情况。结果表明:真核表达载体pIRES-EGFP-MyoG构建成功,且在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中得到了有效表达。说明真核表达载体中的MyoG能够在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中成功表达。

肌损伤基因治疗中的质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD的构建及其在MSCs中的表达

目的 :构建鼠真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2 -EGFP -MyoD ,为研究MyoD对肌损伤的修复作用提供物质基础。方法 :从质粒EMSV上用EcoRI酶切下MyoDcDNA片段 ,进行琼脂凝胶电泳 ,切胶回收纯化 ;EcoRI酶切pIRES2 -EGFP ,将线性化的载体与回收MyoDcDNA片段用T4DNA连接酶连接 ,克隆出双顺反子质粒载体pIRES2 -EGFP -MyoD ,用HindⅢ酶切对重组质粒进行鉴定 :用脂质体转染的方法将重组质粒转入间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)中 ,G4 18筛选 ,在荧光显微镜下观察其表达。结果 :凝胶电泳证明将MyoDcDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内 ,荧光显微镜下可MSCs胞体发出绿色荧光。结论 :成功地构建了鼠真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2 -EGFP -MyoD。

pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定

目的:构建pIRES2-绿色荧光蛋白(EGFP)-骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)真核表达质粒,并检测其表达活性。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人骨肉瘤组织中扩增出人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)的基因片段,构建成pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒,经酶切、测序检测其构建的正确性,通过转染3T3细胞后分别采用RT-PCR、免疫组化及Western免疫印迹(Western blotting,WB)法检测其转录、表达活性。结果:构建的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒经酶切、测序、RT-PCR、免疫组化、EGFP表达鉴定、WB等检验表明质粒构建成功并具有转录活性。结论:本实验成功构建了具有表达活性的hBMP-2真核表达质粒,为进一步研究用BMP-2基因转染的方法来促进实验动物骨折的愈合奠定了基础。

大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP质粒构建及其在HEK293细胞中的表达

提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增μ型阿片受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,纠正点突变后,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,测序及酶切结果表明μ基因正确,μ-pIRES2-EGFP质粒构建成功.用脂质体法将μ-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫组化荧光可以观察到μ基因的高强度表达.

pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞

背景:骨形成蛋白2是骨基质中最重要骨生长因子,主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因。目的:使用前期已经构建成功的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞。设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-12/2008-06在新疆医科大学自治区地方病分子生物学实验室完成。材料:良种新西兰大白兔由新疆医科大学动物试验中心提供,pIRES2-EGFP-BMP-2由本校分子生物学实验室构建、保存。方法:采用贴壁法及密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞。采用脂质体介导转染法将pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞。主要观察指标:通过荧光显微镜、反转录聚合酶链式反应、免疫组织化学及Western免疫印迹检测其转录、表达活性。结果:转染的兔骨髓间充质干细胞细胞可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞,呈胞浆分布,说明重组载体构建成功并能在体细胞中表达。转染pIRES2-EGFP-BMP-2的兔骨髓间充质干细胞经G418抗性筛选并传代、培养4周后,RT-PCR反应可扩增出112kb条带,大小与预期相符合。Western免疫印迹检测显示,经pIRES2-EGFP-BMP-2转染的兔骨髓间充质干细胞经在相对分子质量为30×103处显现单一特异性条带,表明为骨形成蛋白2基因表达产物。免疫组织化学显示,转染pIRES2-EGFP-BMP-2后经G418抗性筛选并传代、培养4周后的兔骨髓间充质干细胞细胞质中有棕黄色颗粒阳性信号。结论:用pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒成功转染兔骨髓间充质干细胞并获得表达。

大鼠κ-HA-pIRES2-EGFP的构建及表达

目的构建带HA标签的大鼠κ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(κ-HA-pIRES2 EGFP),并实现其在HEK293细胞中的表达。方法提取大鼠脑组织总RNA,通过巢式RT-PCR扩增κ型阿片受体全长cDNA,将其克隆至pMD20-T载体中并进行测序鉴定,通过PCR引入HA标签,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的κ-HA-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹检测κ-HA表达。结果测序及酶切结果表明成功获得带HA标签的κ基因,并构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,在荧光显微镜下可观察到转染细胞内有绿色荧光,应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的基因表达。结论利用巢式RT-PCR等技术成功构建了κ-HA-pIRES2-EGFP表达质粒,并在HEK293细胞中实现了高效表达。

大鼠δ阿片受体基因的pIRES2-EGFP质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建大鼠δ阿片受体基因的pIRES2-EGFP表达质粒,并实现其在HEK293细胞的表达。方法提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增δ受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切、连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的δ-pIRES2-EGFP重组子转染入HEK293细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP和δ基因表达情况。结果酶切和测序结果表明δ基因正确构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,转染了重组子的HEK293细胞在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,应用细胞免疫荧光,可以观察到δ基因高强度表达。结论利用巢式RT-PCR等成功构建了δ-pIRES2-EGFP表达质粒,并在HEK293细胞中实现了高效表达。

阿片受体μ-Myc-pIRES2-EGFP的构建及其在CHO细胞中的表达

目的:构建带Myc标签的大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(μ-Myc-pIRES2-EGFP),并实现其在CHO细胞中的表达。方法:以含大鼠全长μ阿片受体基因的μ-pMD20T载体为模板,通过引物设计和扩增,在μ基因C端引入Myc标签,AT克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的μ-Myc-pIRES2-EGFP转染入CHO细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并用细胞免疫荧光和蛋白印迹检测μ-Myc的表达。结果:测序及酶切结果表明获得带Myc标签的μ基因,构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫荧光和蛋白印迹观察到目的基因表达。结论:成功构建了μ-Myc-pIRES2-EGFP表达质粒,并在CHO细胞中实现了高效表达。

突变型人PRKAG2基因的克隆及其真核表达载体构建

目的构建含有突变位点R302Q的PRKAG2的真核表达载体。方法首先通过RT-PCR获得人PRKAG2的基因序列,然后采用PCR定点突变获得含有R302Q的PRKAG2基因序列,最后通过酶切连接至真核表达载体pIRES2-EGFP中。结果通过RT-PCR获得的人PRKAG2的编码区序列1710 bp,经测序比对与NCBI公布的序列完全一致,通过PCR定点突变拼接900 bp和800 bp片段获得了含有R302Q突变位点的PRKAG2,酶切连接至pIRES2-EGFP载体中,经菌落PCR筛选和酶切验证获得阳性克隆pR302Q-IRES2-EGFP,经测序验证与预期完全一致。结论构建含定点突变人PRKAG2基因重组载体pR302Q-IRES-EGFP为进一步研究基因PRKAG2 R302Q突变体的功能奠定了基础。

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。

携带绿色荧光报告基因EBV-LMP2A真核表达载体构建及转染鼻咽癌细胞

目的构建携带绿色荧光基因的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A,并转染至鼻咽癌CNE2细胞。方法从EB病毒阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8中克隆EB病毒编码的EBV潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)序列,并定向克隆入p IRES2-Zs-Green1载体,双酶切及测序鉴定重组的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A;通过脂质体转染将重组的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A转染至鼻咽癌CNE2细胞(实验组),同时另设转染p IRES2-Zs-Green1载体的阴性对照组及未转染的空白对照组。利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达计算细胞转染效率,RT-PCR检测目的基因LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达。结果双酶切及测序鉴定证实真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A构建成功,荧光显微镜下发现实验组和阴性对照组细胞均发出绿色荧光,实验组细胞转染率约为75%;RT-PCR检测发现实验组细胞中有目的基因LMP2A表达,但阴性对照组和空白对照组均未检测到目的基因表达。结论成功构建了p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体并转染鼻咽癌CNE2细胞,目的基因LMP2A可在转染的鼻咽癌CNE2细胞中稳定表达。

鸡防御素基因GAL-2的克隆及其真核表达载体的构建

采用RT-PCR方法从15日龄的仔鸡肾组织的总RNA中扩增出鸡防御素基因(GAL-2)序列,然后将其亚克隆到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GAL-2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到Marc145细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功。pIRES2-EGFP-GAL-2真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GAL蛋白功能以及进一步将其开发为兽用生物制品奠定了基础。

应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系

[目的]探索应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系的筛选方法。[方法]EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接构建目的基因p IRES2-EGFP表达载体并测序确定,Lipofectamine3000转染Hela细胞分为Mock组(未转染组)、NC组(p IRES2-EGFP空载对照组)、重组质粒转染组,转染后24 h消化细胞进行初步筛选(900μg/m LG418),转染后14~16 d将长至肉眼可见的细胞克隆全部重新消化进行二次筛选(方法同初步筛选),转染后28~32 d挑选3个肉眼可见的细胞克隆,实时荧光定量PCR和WB检测目的基因过表达效率。[结果]双酶切及测序确定重组质粒成功构建,与Mock组相比,NC组无明显变化,重组质粒转染组各克隆目的基因mRNA水平分别升高109±8. 3、127±10. 5、122±9. 1倍,P <0. 01,蛋白水平分别升高33±3. 3、45±4. 7、47±4. 9倍,P <0. 01。[结论]该筛选方法 28~32d左右可快速建立Hela细胞稳转细胞系,过表达效率高,可直接进行后续实验。

人端粒酶逆转录酶基因和EGFP共表达真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人端粒酶逆转录酶 (humantelomerasereversetranscriptase ,hTERT)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因共表达重组真核表达质粒。方法 扩增 pGRN1 4 5质粒并酶切回收hTERT片断 ,利用基因重组技术将hTERT连接到 pIRES2 EGFP载体中并酶切鉴定。用NucleofectorTM 技术将构建的重组质粒转染NIH3T3细胞系。结果 成功构建了hTERT和EGFP双基因共表达重组真核表达质粒 ,并成功转染了NIH3T3细胞。结论 重组质粒hTERT pIRES2 EGFP可以被成功导入细胞并表达EGFP 。

HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因真核重组载体的构建和鉴定

目的：构建并鉴定包含人乙型肝炎病毒（HBV）HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因的真核重组载体。方法：采用PCR法扩增HBcAg基因，并通过基因突变在79～80位氨基酸处生成一个NheⅠ酶切位点，然后将这段基因连接到真核表达载体pIRES2-EGFP启动子下游的EcoRⅠ和BamHⅠ之间。同时PCR扩增PreS1第1～65氨基酸基因，并在其两端分别引入NheⅠ酶切位点，通过酶切、连接，将这段基因插入到HBcAg基因的NheⅠ酶切位点上。将构建的重组载体pIREScS1转化大肠杆菌DH5α，分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示，插入片段大小均与预计相符。测序结果与已知序列结果一致。结论：成功构建了HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因的真核重组载体。

α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅶ真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定绿色荧光蛋白为报告基因的pIRES2-EGFP-FUT7真核表达载体。方法采用RT-PCR方法获得α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅶ(FUT7)全长基因,克隆至pMD18-TSim-ple载体后,将FUT7亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体并进行鉴定。结果测序及酶切鉴定证明获得人全长FUT7基因,FUT7基因正确插入pIRES2-EGFP中。结论成功构建了绿色荧光蛋白为报告基因的FUT7真核表达载体,为研究FUT7及其合成的糖抗原sLex在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。

原癌基因c-myc真核表达载体构建及其生物学作用

目的利用基因工程技术构建携带原癌基因c-myc的真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc-c-myc重组质粒并在Hela细胞中表达。方法以构建好的表达质粒pET28a-c-myc为基础,利用PCR方法扩增c-myc基因,并加入EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点,克隆至pMD19-T Simple载体,双酶切后将其与同样经过双酶切的真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc连接,通过PCR、酶切及测序鉴定重组质粒的正确性,再将重组质粒pIRES2-AcGFPl-Nuc-c-myc转染Hela细胞,利用荧光显微镜观察GFP表达,利用MTT和免疫印迹证实c-myc蛋白表达量提高。结果经PCR和酶切鉴定与预期结果相符,测序结果与GenBank中报道的序列完全一致,成功构建了重组表达质粒。免疫印迹证实c-myc基因在Hela细胞中得到表达。MTT结果显示Hela细胞数量显著增加。结论真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc-c-myc成功构建,c-myc基因在Hela细胞中成功表达,具有生物学活性。

重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响

目的 克隆人ｃａｓｐａｓｅ－８催化结构域基因片段，并将其改建成２种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因，转染ＨｅＬａ细胞，观察重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因的表达及其对ＨｅＬａ细胞生长的影响。 方法 用ＲＴ－ＰＣＲ法，克隆人ｃａｓｐａｓｅ－８催化结构域基因片段，经重组ＰＣＲ改造，构建大、小亚基基因次序颠倒的重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因。将其克隆入绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）真核表达载体ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ，转染ＨｅＬａ细胞，用荧光显微镜和倒置显微镜镜观察细胞的形态和结构。 结果用ＲＴ－ＰＣＲ法，成功地克隆了人ｃａｓｐａｓｅ－８催化结构域基因片段，构建了３种重构型人 ｃａｓｐａｓｅ－８基因及其真核表达载体。转染ＨｅＬａ细胞后，重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因的表达可导致ＨｅＬａ细胞死亡。 结论重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因在ＨｅＬａ细胞中的表达可以有效地引起ＨｅＬａ细胞死亡。