肌损伤基因治疗中的质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD的构建及其在MSCs中的表达

目的 :构建鼠真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2 -EGFP -MyoD ,为研究MyoD对肌损伤的修复作用提供物质基础。方法 :从质粒EMSV上用EcoRI酶切下MyoDcDNA片段 ,进行琼脂凝胶电泳 ,切胶回收纯化 ;EcoRI酶切pIRES2 -EGFP ,将线性化的载体与回收MyoDcDNA片段用T4DNA连接酶连接 ,克隆出双顺反子质粒载体pIRES2 -EGFP -MyoD ,用HindⅢ酶切对重组质粒进行鉴定 :用脂质体转染的方法将重组质粒转入间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)中 ,G4 18筛选 ,在荧光显微镜下观察其表达。结果 :凝胶电泳证明将MyoDcDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内 ,荧光显微镜下可MSCs胞体发出绿色荧光。结论 :成功地构建了鼠真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2 -EGFP -MyoD。

pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定

目的:构建pIRES2-绿色荧光蛋白(EGFP)-骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)真核表达质粒,并检测其表达活性。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人骨肉瘤组织中扩增出人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)的基因片段,构建成pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒,经酶切、测序检测其构建的正确性,通过转染3T3细胞后分别采用RT-PCR、免疫组化及Western免疫印迹(Western blotting,WB)法检测其转录、表达活性。结果:构建的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒经酶切、测序、RT-PCR、免疫组化、EGFP表达鉴定、WB等检验表明质粒构建成功并具有转录活性。结论:本实验成功构建了具有表达活性的hBMP-2真核表达质粒,为进一步研究用BMP-2基因转染的方法来促进实验动物骨折的愈合奠定了基础。

真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL,pIRES2-EGFP/CD的构建和鉴定

目的构建真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL和pIRES2-EGFP/CD,为研究其联合表达对恶性胶质瘤的联合治疗作用提供基础。方法将pCMV/CD质粒和pcDNA3.1(+)/TRAIL质粒行琼脂糖凝胶电泳检测,确定其完整性,并进行序列测定确定有无基因突变。pCMV/CD质粒用SacⅡ/XhoⅠ双酶切,pcDNA3.1(+)TRAIL质粒用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,将目的基因定向克隆到真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,转化E.coli DH5α感受态细胞,通过限制性内切酶双酶切、PCR及核酸序列分析等筛选、鉴定重组质粒。结果所构建的真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL经SacⅡ/XhoⅠ双酶切回收片段分别为1.0、5.2 kb;pIRES2-EGFP/CD经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切回收片段分别为1.3、5.2 kb。PCR及测序证实,pIRES2-EGFP/TRAIL和pIRES2-EGFP/CD质粒基因组中分别包含TRAIL和CD基因。结论成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/TRAIL和pIRES2-EGFP/CD,为研究其联合表达对恶性胶质瘤的联合治疗作用奠定了基础。

pIRES2-EGFP-gAd质粒载体构建及在大鼠肾脏的表达

背景:已有研究证实经腹腔注射基因转染肾脏是一种简便有效的实验方法。目的:构建表达球形脂联素(gAd)的pIRES2-EGFP-gAd质粒,观察其在大鼠肾脏的表达。方法:以pET/gAd质粒为模板,PCR扩增目的片段,转化大肠杆菌,用EcoRⅠBamHⅠ双酶切后,与pIRES2-EGFP荧光质粒连接,重组构建pIRES2-EGFP-gAd质粒。将构建成功的pIRES2-EGFP-gAd质粒采用脂质体介导经腹腔注射正常大鼠体内,于注射24,48,96h和7d留取肾脏标本进行冰冻切片,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在肾组织中的表达,同时采用Western bot检测肾组织绿色荧光蛋白的表达。结果与结论:重组构建的pIRES2-EGFP-gAd载体经双酶切电泳分析及DNA测序证实无碱基突变。在腹腔注射脂质体/pIRES2-EGFP-gAd转染复合物24h,即可在肾小球肾间质检测到绿色荧光,注射48h,荧光进一步增强,之后逐渐减弱,至注射7d时,荧光强度明显减弱。Western bot检测的绿色荧光蛋白的表达结果与冰冻组织切片结果一致。说明脂质体能够介导pIRES2-EGFP-gAd真核载体在大鼠肾脏表达。

大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP质粒构建及其在HEK293细胞中的表达

提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增μ型阿片受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,纠正点突变后,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,测序及酶切结果表明μ基因正确,μ-pIRES2-EGFP质粒构建成功.用脂质体法将μ-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫组化荧光可以观察到μ基因的高强度表达.

pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞

背景:骨形成蛋白2是骨基质中最重要骨生长因子,主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因。目的:使用前期已经构建成功的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞。设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-12/2008-06在新疆医科大学自治区地方病分子生物学实验室完成。材料:良种新西兰大白兔由新疆医科大学动物试验中心提供,pIRES2-EGFP-BMP-2由本校分子生物学实验室构建、保存。方法:采用贴壁法及密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞。采用脂质体介导转染法将pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞。主要观察指标:通过荧光显微镜、反转录聚合酶链式反应、免疫组织化学及Western免疫印迹检测其转录、表达活性。结果:转染的兔骨髓间充质干细胞细胞可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞,呈胞浆分布,说明重组载体构建成功并能在体细胞中表达。转染pIRES2-EGFP-BMP-2的兔骨髓间充质干细胞经G418抗性筛选并传代、培养4周后,RT-PCR反应可扩增出112kb条带,大小与预期相符合。Western免疫印迹检测显示,经pIRES2-EGFP-BMP-2转染的兔骨髓间充质干细胞经在相对分子质量为30×103处显现单一特异性条带,表明为骨形成蛋白2基因表达产物。免疫组织化学显示,转染pIRES2-EGFP-BMP-2后经G418抗性筛选并传代、培养4周后的兔骨髓间充质干细胞细胞质中有棕黄色颗粒阳性信号。结论:用pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒成功转染兔骨髓间充质干细胞并获得表达。

大鼠κ-HA-pIRES2-EGFP的构建及表达

目的构建带HA标签的大鼠κ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(κ-HA-pIRES2 EGFP),并实现其在HEK293细胞中的表达。方法提取大鼠脑组织总RNA,通过巢式RT-PCR扩增κ型阿片受体全长cDNA,将其克隆至pMD20-T载体中并进行测序鉴定,通过PCR引入HA标签,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的κ-HA-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹检测κ-HA表达。结果测序及酶切结果表明成功获得带HA标签的κ基因,并构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,在荧光显微镜下可观察到转染细胞内有绿色荧光,应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的基因表达。结论利用巢式RT-PCR等技术成功构建了κ-HA-pIRES2-EGFP表达质粒,并在HEK293细胞中实现了高效表达。

大鼠δ阿片受体基因的pIRES2-EGFP质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建大鼠δ阿片受体基因的pIRES2-EGFP表达质粒,并实现其在HEK293细胞的表达。方法提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增δ受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切、连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的δ-pIRES2-EGFP重组子转染入HEK293细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP和δ基因表达情况。结果酶切和测序结果表明δ基因正确构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,转染了重组子的HEK293细胞在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,应用细胞免疫荧光,可以观察到δ基因高强度表达。结论利用巢式RT-PCR等成功构建了δ-pIRES2-EGFP表达质粒,并在HEK293细胞中实现了高效表达。

阿片受体μ-Myc-pIRES2-EGFP的构建及其在CHO细胞中的表达

目的:构建带Myc标签的大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(μ-Myc-pIRES2-EGFP),并实现其在CHO细胞中的表达。方法:以含大鼠全长μ阿片受体基因的μ-pMD20T载体为模板,通过引物设计和扩增,在μ基因C端引入Myc标签,AT克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的μ-Myc-pIRES2-EGFP转染入CHO细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并用细胞免疫荧光和蛋白印迹检测μ-Myc的表达。结果:测序及酶切结果表明获得带Myc标签的μ基因,构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫荧光和蛋白印迹观察到目的基因表达。结论:成功构建了μ-Myc-pIRES2-EGFP表达质粒,并在CHO细胞中实现了高效表达。

pIRES2-EGFP-MyoG真核表达载体的构建和鉴定

为了构建能够表达日本和牛生肌素(myogenin,MyoG)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP-MyoG,试验从日本和牛成纤维细胞基因组中扩增出MyoG基因,插到带有EGFP和内部核糖体转入位点(IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,经酶切鉴定正确后转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,用RT-PCR和Western-blot检测MyoG基因的表达情况。结果表明:真核表达载体pIRES-EGFP-MyoG构建成功,且在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中得到了有效表达。说明真核表达载体中的MyoG能够在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中成功表达。

人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建

目的 利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-Ⅰ。方法 应用PCR方法从人肝细胞cDNA文库中提取人IGF-Ⅰ全长cDNA序列,克隆人T载体pMD18中,经测序证实序列正确后,进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR证实插入片段的正确性。结果经测序证实,目的基因人IGF-Ⅰ的全长基因序列被正确扩增;构建的真核表达载体经双酶切和PCR鉴定证实,hIGF-Ⅰ被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中。结论 利用基因工程原理可以正确地构建人IGF-Ⅰ全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-Ⅰ。

pIRES2-EGFP-DAZ3质粒构建及金黄地鼠2-细胞胚中人DAZ基因的复制与表达

背景与目的:人Yq11.2上AZF区(内含DAZ基因家族)的缺失是多数男性不育的病因。本研究旨在探讨DAZ3基因导入精子的可能性以及导入基因在2-细胞胚中的功能。材料和方法:构建pIRES2-EGFP-DAZ3质粒,经鉴定无误后将其导入金黄地鼠精子。将携带DAZ3基因的精子与金黄地鼠卵母细胞进行体外受精。用FISH、PCR、RT-PCR技术分别检测DAZ3基因在精子头部、雄原核上的整合以及在2-细胞胚中的复制与表达。结果:构建的pIRES2-EGFP-DAZ3质粒经酶切、PCR和绿色荧光蛋白表达鉴定构建成功。采用FISH在精子头部、单细胞胚雄原核和2-细胞胚两个间期核上观察到阳性杂交信号。采用RT-PCR在2-细胞胚样本中观察到DAZ3cDNA的特异条带。结论:外源性DAZ3基因能被导入精子基因组。携带DAZ3基因的精子可与卵母细胞完成正常的受精过程。导入的DAZ3基因在早期胚胎细胞中能够随细胞分裂自我复制并表达其功能。本研究结果为DAZ基因缺失所致男性不育的治疗提供了新的线索。

人高致病性禽流感病毒H5N1安徽株HA、M2蛋白双顺反子表达载体的构建及表达研究

将我国分离的人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和M2基因片段并克隆至DNA疫苗表达载体pVRC中,构建成真核表达质粒。为提高HA的表达量,按照人偏爱密码子将HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入真核表达载体pVRC,以β-actin蛋白为内参比证明了优化后的HA蛋白表达效果明显提高。将M2基因和优化后的HA基因共同克隆入双顺反子表达载体pIRES中,获得同时表达HA或M2的双顺反子真核表达质粒;通过Western blot和间接免疫荧光检测方法,确认构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和M2。通过上述结果为进一步开展人高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感双价疫苗研发奠定基础。

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。

突变型人PRKAG2基因的克隆及其真核表达载体构建

目的构建含有突变位点R302Q的PRKAG2的真核表达载体。方法首先通过RT-PCR获得人PRKAG2的基因序列,然后采用PCR定点突变获得含有R302Q的PRKAG2基因序列,最后通过酶切连接至真核表达载体pIRES2-EGFP中。结果通过RT-PCR获得的人PRKAG2的编码区序列1710 bp,经测序比对与NCBI公布的序列完全一致,通过PCR定点突变拼接900 bp和800 bp片段获得了含有R302Q突变位点的PRKAG2,酶切连接至pIRES2-EGFP载体中,经菌落PCR筛选和酶切验证获得阳性克隆pR302Q-IRES2-EGFP,经测序验证与预期完全一致。结论构建含定点突变人PRKAG2基因重组载体pR302Q-IRES-EGFP为进一步研究基因PRKAG2 R302Q突变体的功能奠定了基础。

大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表达载体的构建及其在小鼠MSCs细胞中的表达

克隆大鼠NeuroD2基因,旨在构建p IRES2-Ac GFP1-ND2真核表达载体并检测其在小鼠MSCs中的表达。采用RTPCR技术克隆大鼠NeuroD2基因,分析该蛋白质结构、功能域、细胞定位及与其他物种同源性;构建pIRES2-AcGFP1-ND2表达载体并转染小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs);采用Real-time PCR、免疫荧光及Western blot技术检测重组质粒在小鼠MSCs中的表达。结果表明,大鼠NeuroD2基因CDS区全长1 149 bp,共编码382个氨基酸,属于b HLH家族,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,空间结构呈现近似"螺旋-环-螺旋(HLH)"结构,主要分布在细胞核,氨基酸序列与家鼠(99%)、罗猴(98%)、人(97.7%)同源性较高;Real-time PCR结果表明转染组NeuroD2基因表达量显著高于对照组(P<0.05);免疫荧光及Western blot结果显示转染组NeuroD2蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)。成功克隆大鼠NeuroD2基因并构建了pIRES2-AcGFP1-ND2真核表达载体。

携带绿色荧光报告基因EBV-LMP2A真核表达载体构建及转染鼻咽癌细胞

目的构建携带绿色荧光基因的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A,并转染至鼻咽癌CNE2细胞。方法从EB病毒阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8中克隆EB病毒编码的EBV潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)序列,并定向克隆入p IRES2-Zs-Green1载体,双酶切及测序鉴定重组的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A;通过脂质体转染将重组的真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A转染至鼻咽癌CNE2细胞(实验组),同时另设转染p IRES2-Zs-Green1载体的阴性对照组及未转染的空白对照组。利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达计算细胞转染效率,RT-PCR检测目的基因LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达。结果双酶切及测序鉴定证实真核表达载体p IRES2-Zs-Green1-LMP2A构建成功,荧光显微镜下发现实验组和阴性对照组细胞均发出绿色荧光,实验组细胞转染率约为75%;RT-PCR检测发现实验组细胞中有目的基因LMP2A表达,但阴性对照组和空白对照组均未检测到目的基因表达。结论成功构建了p IRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达载体并转染鼻咽癌CNE2细胞,目的基因LMP2A可在转染的鼻咽癌CNE2细胞中稳定表达。

鸡防御素基因GAL-2的克隆及其真核表达载体的构建

采用RT-PCR方法从15日龄的仔鸡肾组织的总RNA中扩增出鸡防御素基因(GAL-2)序列,然后将其亚克隆到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GAL-2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到Marc145细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功。pIRES2-EGFP-GAL-2真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GAL蛋白功能以及进一步将其开发为兽用生物制品奠定了基础。

pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的导入对减毒沙门菌生物学行为的影响

目的探讨真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入对减毒鼠伤寒沙门菌SL3261生物学行为的影响。方法将真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL通过两步电转化获得含pIRES2-EGFP质粒的SL3261,接种于LB培养基中观察其生长特性、革兰染色观察其形态和血清凝集试验检测其表面抗原变化。利用该重组菌体外感染HepG2细胞,观察其对细胞的侵袭能力的影响。结果含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒SL3261在体外生长繁殖较原细菌慢,革兰染色呈阴性丝状菌体,含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261 A-F多价、O4菌体和H1鞭毛抗原和SL3261完全一致;体外感染HepG2能力,SL3261为201±46 CFU/200HepG2细胞,SL3261-pIRES2-EGFP为163±37,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32,3组间的差异无统计意义(P>0.05)。结论导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒对SL3261的生长和形态有部分影响,而表面抗原以及侵入HepG2细胞的功能不变,该结果为含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒SL3261疫苗菌的进一步研究奠定了实验依据。

应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系

[目的]探索应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系的筛选方法。[方法]EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接构建目的基因p IRES2-EGFP表达载体并测序确定,Lipofectamine3000转染Hela细胞分为Mock组(未转染组)、NC组(p IRES2-EGFP空载对照组)、重组质粒转染组,转染后24 h消化细胞进行初步筛选(900μg/m LG418),转染后14~16 d将长至肉眼可见的细胞克隆全部重新消化进行二次筛选(方法同初步筛选),转染后28~32 d挑选3个肉眼可见的细胞克隆,实时荧光定量PCR和WB检测目的基因过表达效率。[结果]双酶切及测序确定重组质粒成功构建,与Mock组相比,NC组无明显变化,重组质粒转染组各克隆目的基因mRNA水平分别升高109±8. 3、127±10. 5、122±9. 1倍,P <0. 01,蛋白水平分别升高33±3. 3、45±4. 7、47±4. 9倍,P <0. 01。[结论]该筛选方法 28~32d左右可快速建立Hela细胞稳转细胞系,过表达效率高,可直接进行后续实验。