非转座子载体介导的转基因家蚕表达hIL-28A

为了探讨非转座子载体介导转基因家蚕表达外源基因的可能性,将hIL-28A克隆进昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,构建了重组载体pIZT/V5-His-hIL-28A.利用精子介导法将该重组载体导入家蚕卵,通过绿色荧光筛选并结合PCR、DNA杂交等分子鉴定,证实成功获得了转基因家蚕.Western blotting结果显示,转基因家蚕表达重组hIL-28A的分子质量为25 ku,ELISA检测结果显示,hIL-28A在G3代转基因蚕、后部丝腺、脂肪组织冻干粉中的含量分别为0.198、0.320和0.238 ng/g.表明通过非转座子载体介导可以将外源基因导入家蚕基因组并实现外源基因的表达.

利用非转座子载体介导的转基因家蚕表达人胰岛素样生长因子Ⅰ

为了实现利用非转座子载体介导的转基因家蚕整体表达人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ),将hIGF-Ⅰ基因克隆进非转座子类型的昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,构建转基因载体pIZT/V5-His-hIGF-Ⅰ。利用精子介导法将该转基因载体导入家蚕卵,通过绿色荧光筛选并结合PCR和Dot blotting检测鉴定,表明已成功获得hIGF-Ⅰ转基因家蚕。对培育至G2代的转基因家蚕5龄幼虫蛋白质样品进行Western blotting分析,结果显示hIGF-Ⅰ在转基因家蚕中获得表达,重组hIGF-Ⅰ的分子质量约12.5 kD;ELISA检测hIGF-Ⅰ在G2代转基因家蚕5龄幼虫全蚕以及后部丝腺、脂肪体冻干粉中的质量比分别为65、411、469 ng/g。试验结果再次证实通过非转座子载体pIZT/V5-His介导可以将外源基因导入家蚕基因组,并实现外源基因在转基因家蚕中整体表达。

稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立稳定转化家蚕细胞持续表达外源基因的技术体系,构建了基于piggyBac转座子的带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)和新霉素抗性基因(neo)表达元件的转基因载体pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA-fib-L-intron1,以及带有hGM-CSF和吉欧霉素(zeocin)抗性基因的昆虫细胞转化载体pIZT-IE-hGM-CSF,分别转染家蚕卵巢BmN细胞,并以含相应抗生素G418或zeocin的培养液筛选,得到稳定的转化细胞系FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF。ELISA检测结果显示,hGM-CSF在FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF转化细胞系的表达水平分别为1.534 55 fg/个细胞和2.227 38 fg/个细胞。

非转座子载体介导的稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立非转座子载体介导的持续表达外源基因的转化家蚕BmN细胞系,将家蚕核型多角体病毒极早期基因(ie-1)启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的表达盒克隆至pIZT/V5-His,获得重组载体pIZT-IE-hGM-CSF,该载体转染家蚕BmN细胞后,通过博莱霉素(Zeocin)筛选获得了稳定转化细胞系IE-hGM-CSF。转基因细胞基因组经PCR鉴定,成功检测到ie-hGM-CSF,Western blotting分析结果显示转化细胞表达的重组hGM-CSF的大小为22kDa,ELISA检测结果显示hGM-CSF在转化细胞系里的表达水平大约为2814.7pg/106个细胞。