利用分枝杆菌的重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌的方法研究

目的利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5′端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3′端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成最终的敲入片段A5THA3;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果。结果重叠PCR技术得到全长为3 200 bp的敲入片段,PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中。结论成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的基因功能研究奠定了基础。

分枝杆菌噬菌体重组体TM4-RpfE的构建

目的·构建分枝杆菌噬菌体(TM4)与复苏促进因子(Rpf)的重组体(TM4-RpfE),为联合抗结核药物实现杀灭结核休眠菌、缩短结核化疗疗程奠定实验基础。方法·电转化法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,制备重组工程菌;提取TM4基因组DNA;重叠PCR扩增目的融合基因hsp60-RpfE,多步重叠PCR扩增插入长片段HHRH(homologous+hsp60-RpfE+homologous);电转化法将噬菌体DNA与插入长片段HHRH共同转入重组工程菌,挑取单噬菌斑进行PCR和测序验证;SDS-PAGE分析重组噬菌体的蛋白表达。结果·重叠PCR扩增出全长901 bp大小的目的融合基因hsp60-RpfE和1 873 bp大小的插入长片段HHRH;PCR验证重组后的噬菌斑,分别在955 bp和301 bp处出现特异性条带;SDS-PAGE分析显示重组型噬菌体在21 000处出现特异性蛋白条带。结论·分枝杆菌噬菌体重组体TM4-RpfE构建成功,初步验证目的基因RpfE得到表达。