柴胡皂苷A调节cAMP/PKA/CREB信号通路对失眠大鼠的改善作用及机制研究

目的基于cAMP/PKA/CREB通路探讨柴胡皂苷A对失眠大鼠的改善作用及机制。方法将75只SD大鼠随机分为空白组、模型组、柴胡皂苷A低剂量组(0.625 mg·kg^(-1))、柴胡皂苷A高剂量组(2.500 mg·kg^(-1))、艾司唑仑组(0.1 mg·kg^(-1)),每组15只。采用腹腔注射苯丙氨酸(PCPA,0.1 mg·kg^(-1))复制失眠大鼠模型。观察大鼠一般情况及昼夜节律;采用戊巴比妥钠翻正实验测定大鼠睡眠潜伏期及睡眠持续时间;观测大鼠睡眠时相,记录慢波睡眠第1期(SWS1)、慢波睡眠第2期(SWS2)、快速眼球运动睡眠期(REMS)时长以及总睡眠时长(TST);qRT-PCR法测定下丘脑节律基因Clock、Bmal1 mRNA及钟控基因Rev-erbα、RorαmRNA的表达水平;免疫荧光法测定海马组织NeuN表达水平;ELISA法测定脑组织中的cAMP水平;Western Blot法测定脑组织中Clock、Bmal1、Rev-erbα、Rorα及cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠昼伏夜出的节律紊乱,极度兴奋,易激惹,睡眠减少;睡眠潜伏期明显延长(P<0.05),睡眠持续时间及SWS1、SWS2、REMS、TST均明显缩短(P<0.05);神经元排列紊乱,NeuN阳性神经元IOD值明显降低(P<0.05);脑组织Clock、Bmal1、Rev-erbα、RorαmRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);脑组织cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,给药组大鼠的攻击性明显减弱,昼伏夜出有节律性,活动减少,睡眠增多;睡眠潜伏期明显缩短(P<0.05),睡眠持续时间及SWS1、SWS2、REMS、TST均明显延长(P<0.05);神经元排列紊乱情况有所恢复,NeuN阳性神经元IOD值明显升高(P<0.05);脑组织Clock、Bmal1、Rev-erbα、RorαmRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05);脑组织cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论柴胡皂苷A可能通过激活cAMP/PKA/CREB通路改善失眠大鼠的昼夜节律。

抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠心肌细胞PKA/CaMKⅡ信号通路及线粒体膜电位的影响

目的通过抗纤益心方干预扩张型心肌病大鼠,探讨该药在扩张型心肌病心肌细胞PKA/CaMKⅡ信号通路及线粒体膜电位方面的作用。方法扩张型心肌病大鼠通过饮用呋喃唑酮复制,连续10周后通过心脏彩超确定模型复制成功,随机分为抗纤益心方低剂量组、抗纤益心方中剂量组、抗纤益心方高剂量组、卡托普利组和模型组,另设正常组。药物干预4周后观察各组大鼠心肌细胞超微结构;心肌细胞ATP、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活力;心肌细胞CaMKⅡ、PKA、UCP2 mRNA表达。用去甲肾上腺素诱导H9c2心肌细胞肥大模型,药物干预24 h后检测心肌细胞线粒体膜电位水平。结果与正常组相比,各模型组大鼠心肌细胞线粒体受损,心肌细胞ATP、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活力明显降低,UCP2 mRNA、CaMKⅡmRNA均明显升高,PKA mRNA明显降低,心肌线粒体膜电位水平明显下降(P<0.05或P<0.01)。各药物干预组对心肌细胞线粒体有不同程度的保护作用,对所测指标有不同程度的改善,尤其以抗纤益心方高剂量组更为明显(P<0.05或P<0.01)。结论抗纤益心方可以减轻DCM模型大鼠心肌细胞线粒体损伤,改善心肌细胞能量代谢及舒缩功能,改善心肌细胞PKA/CaMKⅡ信号通路及线粒体膜电位水平是其机制之一。

麦冬皂苷D调节cAMP/PKA/CREB信号通路对炎症性肠病大鼠炎性损伤的影响

目的:探究麦冬皂苷D调节cAMP/PKA/CREB信号通路对炎症性肠病(IBD)大鼠炎性损伤的影响。方法:将大鼠分为对照组、模型组、麦冬皂苷D低剂量组、麦冬皂苷D高剂量组和麦冬皂苷D高剂量+H-89(cAMP抑制剂)组。检测大鼠质量和大鼠结肠长度;酶联免疫吸附法检测血清IL-17、IL-6、IL-10、TNF-α、cAMP水平;流式细胞术检测大鼠外周血中Th17、Treg细胞比例;HE染色检测结肠组织病理损伤;Western blot检测大鼠结肠组织中Bax、Bcl-2以及cAMP/PKA/CREB信号通路相关蛋白表达。结果:治疗结束后,与对照组相比,模型组大鼠结肠组织显著损伤,体质量、结肠长度、血清IL-10、cAMP水平、外周血Treg细胞比例、结肠组织Bcl-2、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达显著降低,血清IL-17、IL-6、TNF-α水平、外周血中Th17比例和Th17/Treg比值、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组相比,麦冬皂苷D低、高剂量组大鼠结肠组织显著减轻,体质量、结肠长度、血清IL-10、cAMP水平、外周血Treg细胞比例、结肠组织Bcl-2、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达显著升高,血清IL-17、IL-6、TNF-α水平、外周血中Th17比例和Th17/Treg比值、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05);H-89可部分逆转麦冬皂苷D对炎症性肠病大鼠的治疗作用(P<0.05)。结论:麦冬皂苷D可降低IBD大鼠炎症反应和结肠组织损伤,可能是通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路实现的。

基于PACAP-cAMP-PKA信号通路探讨J型针刀调节神经源性膀胱逼尿肌的效应机制

目的:探讨J型针刀通过PACAP-cAMP-PKA信号通路改善脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠逼尿肌的作用机制。方法:36只SD雄性大鼠随机分为6组:空白组、假手术组、模型组、J型针刀治疗组、治疗+Bupivacaine抑制剂组、治疗+H-89抑制剂组,各6只。采用脊髓横断法制作神经源性膀胱模型。空白组为正常SD大鼠;假手术组为切开相关部位组织,无脊髓切断;其余4组予以手术脊髓切断造模。J型针刀治疗组造模后第19天予J型针刀针刺大鼠次髎穴,2 d 1次,共治疗7次。干预结束后各组行HE染色观察膀胱逼尿肌组织形态变化,Elisa检测膀胱逼尿肌组织中c AMP、PKA含量,免疫组化检测膀胱逼尿肌组织中PACAP38蛋白表达,Western blot检测膀胱逼尿肌组织中PKA、p-MLC蛋白表达。结果:HE染色结果显示,与空白组相比,模型组中膀胱逼尿肌组织严重坏死,可见大量炎症细胞浸润;与模型组相比,J型针刀治疗组、治疗+Bupivacaine抑制剂组及治疗+H-89抑制剂组均有不同程度坏死组织修复情况。免疫组化检测PACAP38蛋白表达在模型组中表达量最低,针刀治疗之后,PACAP38表达量均不同程度上调;与J型针刀治疗组相比,治疗+Bupivacaine抑制剂组及治疗+H-89抑制剂组PACAP38蛋白表达均不同程度下调(P<0.05),但高于模型组(P<0.05)。Elisa检测结果显示,cAMP、PKA表达量模型组显著下调(P<0.05),J型针刀治疗组与模型组比显著上调(P<0.05),治疗+Bupivacaine抑制剂组及治疗+H-89抑制剂组比无显著差异(P>0.05)。WB结果显示:与空白组相比,模型组PKA、p-MLC蛋白表达上调;针刀治疗组表达量下调,其中PKA蛋白表达有显著性(P<0.05),p-MLC蛋白表达无显著性(P>0.05)。与J型针刀治疗组比,PKA蛋白表达量在治疗+Bupivacaine抑制剂组及治疗+H-89抑制剂组中无显著差异(P>0.05),p-MLC蛋白表达量显著下降(P<0.05)。结论:J型针刀针刺次髎穴可改善脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱功能,其机制与J型针刀上调膀胱逼尿肌中PACAP38、cAMP、PKA表达,激活PACAP-cAMP-PKA信号通路,从而促进逼尿肌舒张有关。

射干药效物质基础成分鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A的pKa值测定

目的 采用高效液相色谱法测定鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A的pKa值,为其剂型设计提供参考。方法 采用乙腈-不同pH值磷酸缓冲盐水溶液为流动相,在检测波长265 nm下,依次测定鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A的保留因子,从而计算pKa。结果 鸢尾黄素的pKa为6.49、鸢尾甲黄素A的pKa为6.51。结论 采用高效液相色谱法测定鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A的pKa值,方法简便、有效。

二元有机酸pKa值的测定基于有机酸分析及醋酸电位滴定实验的改进

有机酸分析、醋酸的电位滴定两个实验被许多高校列为分析实验项目。鉴于存在实验内容过于简单、实验仪器大班开放难以人手一套的问题,本文对两个实验项目进行了创新设计与改进:结合科研成果,改进了电位滴定测定pKa的全过程跟踪为三点测定,节省了仪器使用时间,实现了同学独立实验、合用实验仪器,解决了仪器台套数不足的难题;设计了基于基本概念、原理、计算推演实验结果,实现了二元有机弱酸的浓度及pKa的测定,解决了理论与实验脱节的现象,解决了理论与应用脱节的问题,提升了实验教学的难度、挑战度和创新性,激发了学生求本溯源的学习态度。

参榆洗液对痔术后大鼠痛觉敏化及cAMP/PKA信号通路和TRPV1蛋白表达的影响

目的探讨参榆洗液对痔术后大鼠痛觉敏化及环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)信号通路、香草酸瞬时受体亚型1(TRPV1)蛋白表达的影响。方法取40只雄性SD大鼠,随机选择其中8只作为空白组,其余大鼠采用冰醋酸建立痔术后创面模型。将造模成功大鼠随机分为模型组及参榆洗液低、中、高剂量组,每组8只。自成功造模后的第1天开始,模型组给予高压灭菌水局部熏洗,参榆洗液低、中、高剂量组分别予以参榆洗液0.4 g生药/mL、0.8 g生药/mL、1.6 g生药/mL局部熏洗,均2次/d,每次15 min,2次治疗间隔12 h,连续7 d。记录大鼠第1,4,7天换药刺激后3 min内首次舔舐肛周创面潜伏时间、扭体反应次数以及舔舐肛周创面总时间,观察造模后和干预3,5,7 d后创面情况并记录创面愈合率,HE染色观察干预7 d后创面组织病理学形态,Western blot法检测干预7 d后创面组织中cAMP、PKA蛋白和背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白表达情况。结果与空白组比较,模型组大鼠首次舔舐肛周创面潜伏时间明显缩短(P<0.05),扭体反应次数明显增加(P<0.05),舔舐肛周创面总时间明显延长(P<0.05);创面组织中有大量中性粒细胞与淋巴细胞浸润,组织水肿明显;创面组织中cAMP、PKA蛋白相对表达量及背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。与模型组比较,参榆洗液中、高剂量组大鼠首次舔舐肛周创面潜伏时间明显延长(P均<0.05),扭体反应次数明显减少(P均<0.05),舔舐肛周创面总时间明显缩短(P均<0.05);参榆洗液各组干预5,7 d后创面愈合率更高(P均<0.05);参榆洗液各组大鼠创面组织中中性粒细胞、淋巴细胞浸润减少,成纤维细胞、新生血管增多;参榆洗液各组创面组织中cAMP、PKA蛋白相对表达量及背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),且呈剂量依赖性下降(P均<0.05)。结论参榆洗液可呈剂量依赖性改善痔术后大鼠痛觉敏化,促进创面愈合,机制可能与下调cAMP/PKA信号通路相关蛋白及TRPV1蛋白表达有关。

基于cAMP/PKA/CREB信号通路探讨固本止咳方治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期小鼠的作用机制

目的基于环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)信号通路探讨固本止咳方(GBZK)治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期小鼠的作用机制。方法60只BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、GBZK组、地塞米松组,除对照组外,其余组均使用烟草烟雾暴露联合脂多糖复制COPD稳定期小鼠模型。造模成功后,GBZK组予GBZK 0.2 mL/d灌胃,地塞米松组予1.0 mg/kg地塞米松注射液腹腔注射,2次/d,所有小鼠均给药28 d。观察各组小鼠一般情况,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠肺组织匀浆cAMP水平,利用Western blot检测小鼠肺组织匀浆中cAMP、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表达情况。结果与模型组比较,GBZK组小鼠的喘息气促有所改善,肺组织匀浆中cAMP含量及cAMP、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表达均提高(P<0.05)。结论固本止咳方可能通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路,进而发挥对COPD稳定期小鼠的保护作用。

中医药从“阴阳失调”理论调控cAMP/PKA信号通路治疗注意缺陷多动障碍的研究进展

注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)难控制、易反复,严重损害儿童运动、情绪及学习生活。ADHD发病机制不明,涉及神经递质传递、神经炎症及氧化应激等,病机本质责之于“阴阳失调”。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号通路的激活可诱导一系列蛋白底物磷酸化而参与运动及学习记忆的形成,并能促进神经递质合成,抑制促炎因子和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的释放而改善ADHD的核心症状,且该通路失调所导致的能量代谢障碍、神经冲动传递异常与中医“阴阳失调”理论不谋而合。中医药通过干预cAMP/PKA信号通路恢复阴阳平衡对儿童ADHD的防治发挥了重要作用,并有效解决了精神类药品在儿童中使用受限的问题。基于ADHD中医药研究的日益增多,本文阐述了cAMP/PKA信号通路的结构、传导及其与ADHD机制、中医病机及辨证分型的关系,归纳了中药复方、单体及单味中药干预cAMP/PKA信号通路治疗ADHD的研究现状,旨在为ADHD的中药药理学研究提供依据,丰富ADHD“阴阳失调”的中医理论内涵,为ADHD的防治提供新见解、新方向。

PGE_(2)通过EP4/PKA信号通路调控滑膜细胞OAT1的表达及CP-25的作用

目的明确前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE_(2))对滑膜细胞有机阴离子转运体1(organic anion transporter 1,OAT1)膜表达的调控机制及芍药苷-6'-O-苯磺酸酯(CP-25)的作用。方法免疫荧光法检测不同浓度CP-25对PGE_(2)处理后滑膜细胞OAT1和前列腺素E受体4(prostaglandin E receptor 4,EP4)表达的影响;使用EP4激动剂(TCS2510)与拮抗剂(GW627368X),探究EP4在OAT1调节中的作用;使用CP-25和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89,探究CP-25和PKA对滑膜细胞OAT1表达的影响。结果PGE_(2)在0~10 min内明显下调EP4与OAT1的膜表达,20~60 min后明显上调(P<0.05);CP-25明显上调PGE_(2)处理后细胞膜OAT1和EP4的表达(P<0.05);EP4激动剂TCS2510明显上调细胞膜OAT1的表达(P<0.01);CP-25上调PGE_(2)处理的细胞中OAT1的表达,GW627368X和H-89均能下调PGE_(2)和CP-25处理的滑膜细胞中OAT1的表达(P<0.01)。结论PGE_(2)介导的EP4/PKA信号通路可以调控OAT1在滑膜细胞膜上的表达,CP-25可以通过活化EP4/PKA信号通路明显上调滑膜细胞中OAT1的膜表达。

益气逐瘀解毒颗粒对肝纤维化模型大鼠GIV及下游信号通路PKA/CREB表达的影响

目的观察益气逐瘀解毒颗粒对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl 4)诱导的肝纤维化模型大鼠的抗纤维化作用及其对与Gα相互作用的囊泡相关蛋白(Gα-interacting vesicle-associated protein,GIV)、下游信号通路蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein,CREB)表达水平的影响并探讨其作用机制。方法SD雄性大鼠予以CCl 4橄榄油混合物腹部皮下注射7周诱导肝纤维化模型,造模成功后随机分为益气逐瘀解毒颗粒高、中、低剂量组,扶正化瘀组及模型对照组,另设阴性对照组,共6组,每组大鼠8只。益气逐瘀解毒颗粒高、中、低剂量组分别予益气逐瘀解毒颗粒10.8 g/(kg·d)、5.4 g/(kg·d)、2.7 g/(kg·d)灌胃给药,扶正化瘀组予扶正化瘀胶囊0.405 g/(kg·d)灌胃给药,其余组等量蒸馏水灌胃,持续5周后处死大鼠收集标本。检测外周血丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST);肝组织苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)、MASSON染色检测肝纤维化程度;免疫组化法检测肝组织α-平滑肌激动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)含量,并采用实时荧光定量PCR法(real time quantitative PCR,RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法分别检测大鼠肝组织中Ⅰ型胶原α1链(collagen type I alpha 1 chain,Col1A1)、Ⅰ型胶原α2链(collagen type I alpha 2 chain,Col1A2)、GIV、PKA、CREB mRNA和蛋白表达水平。结果益气逐瘀解毒颗粒可减少肝纤维化模型大鼠胶原纤维增生及肝细胞损伤,且与模型对照组相比,益气逐瘀解毒颗粒各剂量组α-SMA含量显著下降(P<0.05),Col1A1、Col1A2、GIV表达显著下调(P<0.05),益气逐瘀解毒颗粒高、中剂量组PKA表达上调(P<0.05),中剂量组CREB表达显著上调(P<0.05);与扶正化瘀组比较,益气逐瘀解毒颗粒高、中剂量组α-SMA含量显著下降(P<0.05),高剂量组GIV表达下调(P<0.05),中剂量组PKA表达上调(P<0.05)。结论益气逐瘀解毒颗粒对CCl 4诱导的肝纤维化模型大鼠具有抗肝纤维化作用,可能与调节GIV表达及其下游信号通路PKA/CREB的表达有关。

补阳还五汤通过cAMP/PKA/PPARγ通路调控脂质代谢抗大鼠脑缺血再灌注损伤的作用

目的探究补阳还五汤通过cAMP/PKA/PPARγ通路调控脂质代谢抗大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机理。方法将60只大鼠随机分为假手术组、模型组、丁苯酞组及补阳还五汤低、中、高剂量组。采用短暂性大脑中动脉栓塞法制备脑缺血再灌注模型,补阳还五汤低、中、高剂量组予不同剂量补阳还五汤灌胃(6.413、12.825、25.65 g·kg^(-1)),丁苯酞(NBP)组予丁苯酞灌胃(54 mg·kg^(-1)),假手术组和模型组予等体积蒸馏水灌胃,连续14 d。对大鼠进行神经行为学评分,HE染色观察大脑病理变化,试剂盒检测缺血侧磷酸胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、甘油二酯(DAG)、游离脂肪酸(FFA)含量,RT-qPCR和WesternBlot法检测环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)中mRNA及蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分明显升高(P<0.01);缺血侧皮质出现病理形态损伤;PC、PE含量降低,DAG、FFA含量升高(P<0.01);cAMP的mRNA升高(P<0.05)。与模型组比较,补阳还五汤低剂量组神经功能缺损评分降低(P<0.05),补阳还五汤中、高剂量组和丁苯酞组神经功能缺损评分明显降低(P<0.01);各给药组细胞排列相对规整,细胞间隙减小,正常细胞增多;补阳还五汤中、高剂量组和丁苯酞组PC、PE明显升高,DAG、FFA明显降低(P<0.01);补阳还五汤低剂量组PC升高,FFA、DAG明显降低(P<0.05,P<0.01);补阳还五汤低剂量组PPARγ的mRNA表达升高(P<0.05),补阳还五汤中、高剂量组和丁苯酞组cAMP、PKA、PPARγ的mRNA及蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠具有神经保护作用,其机制可能与调控cAMP/PKA/PPARγ信号通路关键因子的表达,调节脂质代谢有关。

枳术丸调控VIP、cAMP、PKA、AQP1对慢传输型便秘小鼠肠道水液代谢的影响

目的探讨枳术丸对慢传输型便秘脾虚证小鼠肠道水液代谢的影响。方法用番泻叶灌胃+饥饱失常法建立慢传输型便秘脾虚证小鼠模型并随机分为模型组(蒸馏水)、莫沙必利组(2.5mg·kg^(-1))、枳术丸组(11.7g·kg^(-1)),另设空白组(蒸馏水),每组10只。分组治疗7d后,观察各组小鼠的一般行为学特征,检测各组小鼠肠道推进率、粪便含水量,采用HE染色观察各组小鼠结肠组织病理形态改变,Elisa法检测小鼠结肠血管活性肠肽(VIP)、环磷腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)含量,Western-Blot检测结肠cAMP、PKA、水通道蛋白1(AQP1)蛋白表达。结果与空白组相比,模型组肠道推进率、粪便含水量均减少(P<0.05),Elisa法检测示结肠组织VIP、cAMP、PKA含量均降低(P<0.05或P<0.01),Western-Blot结果示结肠组织cAMP、PKA蛋白表达减少(P>0.05,P<0.01),AQP1蛋白表达增加(P<0.05)。与模型组比较,莫沙必利组和枳术丸组肠道推进率呈增加趋势(P>0.05),粪便含水量增加(P<0.05)。Elisa法检测示结肠组织VIP呈上升趋势(P>0.05),cAMP、PKA含量均明显增加(P<0.01),Western-Blot结果示结肠组织cAMP、PKA蛋白表达增加(P>0.05,P<0.01),AQP1蛋白表达减少(P<0.05)。结论枳术丸可以改善慢传输型脾虚证便秘小鼠的便秘症状,其机制可能与上调VIP-cAMP-PKA通路从而降低结肠AQP1表达,减少肠道水分重吸收,软化大便有关。

重组糖蛋白激素β5/α2调控cAMP/PKA/CREB通路促进3T3-L1细胞脂肪分解的作用及机制研究

目的研究重组糖蛋白激素β5/α2(rCGH)对3T3-L1脂肪细胞脂解的影响,并探究其潜在机制。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导分化为成熟脂肪细胞,给予不同浓度rCGH干预24 h。以CCK-8法检测3T3-L1脂肪细胞的细胞活力,酶学方法测定细胞内甘油三酯(TG)及培养上清中甘油的水平,油红O染色观察脂滴变化。Western blot检测各组脂肪细胞中HSL和ATGL脂解蛋白的表达水平。不同浓度rCGH加或不加PKA抑制剂H89对已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞进行联合干预实验,将培养细胞分为对照组、H89预处理组、1μmol·L^(-1)rCGH组和(1μmol·L^(-1)rCGH+H89)联合干预组。酶法测定胞内TG及游离甘油的含量,Western blot检测CREB及脂解相关蛋白的表达。结果不同浓度rCGH(0.25、0.5、1、2μmol·L^(-1))对脂肪细胞细胞活力无显著影响(P>0.05);与对照组相比,rCGH处理显著降低了脂滴大小和细胞内TG含量,同时显著升高了细胞上清液中的甘油浓度。rCGH处理还刺激了p-HSL、ATGL和p-PKA的蛋白表达。此外,加入PKA抑制剂H89,减弱了rCGH对游离甘油水平、细胞内TG含量以及p-HSL、p-PLIN1和p-CREB表达的影响。结论rCGH通过上调HSL、ATGL和PKA活性促进3T3-L1脂肪细胞的脂质分解,促进甘油释放,抑制TG合成和脂质积累,其作用机制与cAMP/PKA/CREB信号通路激活有关。

参榆洗液改善痔术后大鼠痛觉敏化及对cAMP/PKA信号通路的影响

目的:基于环磷酸腺苷/蛋白激酶A(c AMP/PKA)信号通路探究参榆洗液对痔术后大鼠疼痛的影响。方法:构建痔术后大鼠模型,将造模成功的56只SD大鼠随机分为模型组、溶剂模型组、参榆洗液组、参榆洗液+Forskolin(c AMP/PKA信号通路激动剂)组、Forskolin组、H-89(c AMP/PKA信号通路抑制剂)组、NS-398(PGE_(2)抑制剂)组,每组8只;另取8只大鼠为空白组。各组大鼠给予对应药物干预,连续7 d。给药结束后1 d,观察大鼠一般状态及疼痛相关动物学行为,观察创面变化并计算创面愈合率,苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠创面组织病理学改变,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测各组大鼠背根神经节TRPV1、p-PKA蛋白表达及创面组织中c AMP、PKA蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠创面组织中c AMP m RNA、PKA m RNA表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测创面组织中PGE_(2)、IL-6、IL-1β含量。结果:模型组大鼠背根神经节组织中p-PKA、TRPV1及创面周围组织c AMP、PKA、PGE_(2)、c AMP m RNA、PKA m RNA、IL-6、IL-1β表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,H-89组、NS-398组、参榆洗液+Forskolin组、参榆洗液组创面组织病变程度减轻,创面愈合率依次上升,背根神经节组织中p-PKA、TRPV1及创面组织c AMP、PKA、c AMP m RNA、PKA m RNA、IL-6、PGE_(2)、IL-1β表达水平依次降低(P<0.05);Forskolin干预能显著提高痔术后大鼠模型c AMP、PKA、TRPV1、p-PKA、PGE_(2)、IL-6、IL-1β表达水平(P<0.05),与参榆洗液联合干预后,上述蛋白及炎症因子表达水平显著下降(P<0.05)。结论:参榆洗液对痔术后大鼠cAMP/PKA信号通路有抑制作用,抑制c AMP/PKA信号通路可改善痔术后痛觉敏化,其机制可能与抑制PGE_(2)表达、减少炎症因子释放、抑制TRPV1活化有关。

优化新生脉散方调控β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

目的 基于β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路探讨优化新生脉散方对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响。方法 50只SD大鼠随机分为假手术组10只和手术组40只,采用左冠状动脉前降支结扎法建立心力衰竭大鼠模型。将成模大鼠随机分为模型组、卡托普利组和中药低、高剂量组,每组8只,给药组分别予相应药物灌胃4周。超声心动图测定大鼠左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS),测定心、肺质量并计算心、肺脏器系数,组织病理学观察心肌纤维化程度,ELISA测定血清N端脑利钠肽前体(NT-ProBNP)及心肌组织环磷酸腺苷(cAMP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)含量,免疫组化检测心肌组织β1肾上腺素受体(β1-AR)、cAMP阳性表达,Western blot检测心肌组织β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路相关蛋白表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠LVEF、LVFS明显降低(P<0.01),心、肺脏器系数明显升高(P<0.01);心肌细胞数目减少、胶原容积分数升高、Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维占比增加(P<0.01),血清NT-ProBNP和心肌组织ColⅠ、ColⅢ含量明显升高,心肌组织cAMP含量明显降低(P<0.01),心肌组织β1-AR和cAMP阳性表达明显降低(P<0.01),β1-AR、腺苷酸环化酶(AC)1、cAMP、p-蛋白激酶A(PKA)、p-环磷腺苷反应元件结合蛋白(CREB)蛋白表达明显降低,p-Smad2、ColⅠ、ColⅢ、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,给药组不同程度增加大鼠LVEF、LVFS,降低心、肺脏器系数;增加心肌细胞数目、减少胶原容积分数和Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维占比,下调血清NT-ProBNP和心肌组织ColⅠ、ColⅢ含量,上调cAMP含量,增加心肌组织β1-AR和cAMP阳性表达,上调β1-AR、AC1、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白表达,抑制p-Smad2、ColⅠ、ColⅢ、α-SMA蛋白表达,其中中药高剂量组和卡托普利组作用更明显(P<0.01,P<0.05)。结论 优化新生脉散方能减轻心力衰竭大鼠心肌纤维化程度,改善心肌肥厚和重构,增加左心室收缩力,其机制可能与激活β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路有关。

莫诺苷调节cAMP/PKA信号通路对帕金森病大鼠神经炎症的影响

目的探讨莫诺苷调节环磷腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信号通路对帕金森病大鼠神经炎症的影响。方法将30只大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组和莫诺苷组,每组各10只。大鼠颈背部皮下注射鱼藤酮构建帕金森病大鼠模型。莫诺苷组灌胃莫诺苷180 mg·kg^(-1)·d^(-1),正常组和模型组灌胃等剂量0.9%氯化钠溶液,各组均每日1次,连续灌胃14 d。采用苏木精-伊红染色观察海马神经元组织学变化;各组大鼠腹腔注射0.5 mg/kg盐酸去水吗啡,诱发大鼠向左侧选择,记录大鼠旋转持续时间和旋转频率;以酶联免疫吸附试验测定脑组织中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、cAMP和PKA水平;采用实时荧光定量PCR法测定cAMP/PKA mRNA表达;采用蛋白质印迹法测定cAMP/PKA蛋白表达。结果模型组和莫诺苷组大鼠旋转频率和持续时间均高(长)于正常组,莫诺苷组大鼠旋转频率和持续时间均低(短)于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组和莫诺苷组IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于正常组,莫诺苷组IL-1β、IL-6和TNF-α水平均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组和莫诺苷组cAMP和PKA水平均低于正常组,莫诺苷组cAMP和PKA水平均高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组和莫诺苷组cAMP和PKA mRNA相对表达量均低于正常组,莫诺苷组cAMP和PKA mRNA相对表达量均高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组和莫诺苷组cAMP和PKA蛋白灰度值均低于正常组,莫诺苷组cAMP和PKA蛋白灰度值均高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论莫诺苷可减轻帕金森病大鼠神经炎症,其机制可能与激活cAMP/PKA信号通路有关。

基于cAMP-PKA-CREB信号通路中药防治血管性痴呆的研究进展

环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)-cAMP响应性元件结合蛋白(CREB)是神经系统一条重要的信号途径,在血管性痴呆(Va D)的防治方面发挥重要作用。中医药是我国治疗Va D的重要手段,其主要优势在于保护脑血管、改善学习记忆与认知功能的效果显著且无明显不良反应。本文基于cAMP-PKA-CREB信号通路在脑血管病变和记忆认知功能方面的调节机制,从单味中药及中药复方的角度综述了中药防治Va D的作用机制,为今后Va D相关基础及临床研究提供理论依据。

基于cAMP/PKA/CREB信号通路探讨柴胡皂苷对多发性抽动症小鼠的治疗作用

目的基于环磷酸腺苷/蛋白激酶A/环磷酸腺苷反应成分结合蛋白(cAMP/PKA/CREB)信号通路探讨柴胡皂苷(SS)对多发性抽动症(TS)模型小鼠的治疗作用。方法将小鼠随机分为对照组、TS组、SS低剂量(SS-L)组、SS高剂量(SS-H)组、阳性药物组、SS-H+PKA抑制剂(H-89)组,每组10只。除对照组外,其他各组经腹腔注射亚氨基二丙腈溶液建立TS小鼠模型。造模后,SS-L组、SS-H组分别给予25、100 mg/kg SS腹腔注射,并以生理盐水灌胃;阳性药物组以0.5 mg/kg氟哌啶醇灌胃,并以生理盐水腹腔注射;SS-H+H-89组以100 mg/kg SS、5 mg/kg H-89腹腔注射,并以生理盐水灌胃;TS组及对照组分别以等体积的生理盐水腹腔注射、灌胃。每天1次,连续干预3周。对小鼠运动行为、刻板行为进行评分,用ELISA法检测纹状体组织中5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)以及多巴胺(DA),用苏木精-伊红法观察脑组织形态学变化,用免疫组化法检测黑质中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元,用Western blotting法检测cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,TS组脑细胞形态被破坏,干预1、2、3周小鼠运动行为评分、刻板行为评分及纹状体组织中NE、DA水平、TH阳性神经元数量高(P均<0.05),纹状体组织中5-HT水平及cAMP、PKA、CREB蛋白表达低(P均<0.05);与TS组比较,SS-L组、SS-H组、阳性对照组脑细胞形态得到改善,干预1、2、3周小鼠运动行为评分、刻板行为评分及纹状体组织中NE、DA水平、TH阳性神经元数量低(P均<0.05),纹状体组织中5-HT水平及cAMP、PKA、CREB蛋白表达高(P均<0.05);S-H+H-89组逆转SS-H组各指标的变化(P均<0.05)。结论SS可能通过调节cAMP/PKA/CREB信号通路对TS小鼠发挥治疗作用。

胡椒碱调节AC/PKA/CREB信号通路对脑梗死大鼠海马神经元凋亡的影响

目的:探讨胡椒碱(PIP)对脑梗死大鼠神经损伤的影响及机制。方法:采用改良线栓法制备脑梗死大鼠模型,将大鼠分为Sham组、Model组、PIP组(PIP组,20 mg/kg PIP)、PIP^(+)PKA抑制剂组(PIP^(+)H-89组,20 mg/kg PIP^(+)5 mg/kg H-89)。各组大鼠进行神经功能缺损评分,观察脑梗死体积、神经元损伤及神经元凋亡,检测海马组织cAMP、IL-1β和IL-6水平及GFAP、NSE、AC6、PKA、p-CREB、CREB、BDNF蛋白表达。结果:与Sham组比较,Model组出现大面积脑梗死,脑梗死体积、神经功能缺损评分、神经元凋亡率、海马组织IL-6、IL-1β水平、GFAP阳性细胞数、NSE蛋白阳性表达率升高,海马组织尼氏体数目、cAMP及AC6、PKA、p-CREB、BDNF蛋白表达水平降低(P<0.05);与Model组比较,PIP组脑梗死体积、神经功能缺损评分、神经元凋亡率、海马组织IL-6、IL-1β水平、GFAP阳性细胞数、NSE蛋白阳性表达率降低,海马组织尼氏体数目、cAMP及AC6、PKA、pCREB、BDNF蛋白表达水平升高(P<0.05);胡椒碱改善脑梗死大鼠神经损伤的作用可被H-89逆转。结论:PIP可通过激活AC/PKA/CREB信号通路抑制海马神经元凋亡,改善脑梗死引起的神经损伤。