PGE_(2)通过EP4/PKA信号通路调控滑膜细胞OAT1的表达及CP-25的作用

目的明确前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE_(2))对滑膜细胞有机阴离子转运体1(organic anion transporter 1,OAT1)膜表达的调控机制及芍药苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)的作用。方法免疫荧光法检测不同浓度CP-25对PGE_(2)处理后滑膜细胞OAT1和前列腺素E受体4(prostaglandin E receptor 4,EP4)表达的影响;使用EP4激动剂(TCS2510)与拮抗剂(GW627368X),探究EP4在OAT1调节中的作用;使用CP-25和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89,探究CP-25和PKA对滑膜细胞OAT1表达的影响。结果PGE_(2)在0~10 min内明显下调EP4与OAT1的膜表达,20~60 min后明显上调(P<0.05);CP-25明显上调PGE_(2)处理后细胞膜OAT1和EP4的表达(P<0.05);EP4激动剂TCS2510明显上调细胞膜OAT1的表达(P<0.01);CP-25上调PGE_(2)处理的细胞中OAT1的表达,GW627368X和H-89均能下调PGE_(2)和CP-25处理的滑膜细胞中OAT1的表达(P<0.01)。结论PGE_(2)介导的EP4/PKA信号通路可以调控OAT1在滑膜细胞膜上的表达,CP-25可以通过活化EP4/PKA信号通路明显上调滑膜细胞中OAT1的膜表达。

参榆洗液对痔术后大鼠痛觉敏化及cAMP/PKA信号通路和TRPV1蛋白表达的影响

目的探讨参榆洗液对痔术后大鼠痛觉敏化及环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)信号通路、香草酸瞬时受体亚型1(TRPV1)蛋白表达的影响。方法取40只雄性SD大鼠,随机选择其中8只作为空白组,其余大鼠采用冰醋酸建立痔术后创面模型。将造模成功大鼠随机分为模型组及参榆洗液低、中、高剂量组,每组8只。自成功造模后的第1天开始,模型组给予高压灭菌水局部熏洗,参榆洗液低、中、高剂量组分别予以参榆洗液0.4 g生药/mL、0.8 g生药/mL、1.6 g生药/mL局部熏洗,均2次/d,每次15 min,2次治疗间隔12 h,连续7 d。记录大鼠第1,4,7天换药刺激后3 min内首次舔舐肛周创面潜伏时间、扭体反应次数以及舔舐肛周创面总时间,观察造模后和干预3,5,7 d后创面情况并记录创面愈合率,HE染色观察干预7 d后创面组织病理学形态,Western blot法检测干预7 d后创面组织中cAMP、PKA蛋白和背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白表达情况。结果与空白组比较,模型组大鼠首次舔舐肛周创面潜伏时间明显缩短(P<0.05),扭体反应次数明显增加(P<0.05),舔舐肛周创面总时间明显延长(P<0.05);创面组织中有大量中性粒细胞与淋巴细胞浸润,组织水肿明显;创面组织中cAMP、PKA蛋白相对表达量及背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。与模型组比较,参榆洗液中、高剂量组大鼠首次舔舐肛周创面潜伏时间明显延长(P均<0.05),扭体反应次数明显减少(P均<0.05),舔舐肛周创面总时间明显缩短(P均<0.05);参榆洗液各组干预5,7 d后创面愈合率更高(P均<0.05);参榆洗液各组大鼠创面组织中中性粒细胞、淋巴细胞浸润减少,成纤维细胞、新生血管增多;参榆洗液各组创面组织中cAMP、PKA蛋白相对表达量及背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),且呈剂量依赖性下降(P均<0.05)。结论参榆洗液可呈剂量依赖性改善痔术后大鼠痛觉敏化,促进创面愈合,机制可能与下调cAMP/PKA信号通路相关蛋白及TRPV1蛋白表达有关。

袖状胃切除术通过GLP-1激活cAMP/PKA通路拮抗血管外周脂肪组织炎症

目的基于GLP-1激活环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)通路探讨袖状胃切除术拮抗血管外周脂肪组织炎症。方法选取SPF级六周龄雄性大鼠48只作为本次研究的对象,无差别分为空白组、袖状胃切除术组以及GLP-1受体激动剂组、GLP-1受体拮抗剂组Exendin(9-39),对四组小鼠血管外周脂肪组织的cAMP/PKA水平以及炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α水平进行测定。结果(1)cAMP/PKA水平比较:GLP-1受体激动剂进一步升高袖状胃切除术小鼠血管外周脂肪组织cAMP/PKA水平,其拮抗剂显著降低血管外周脂肪组织cAMP/PKA水平,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(2)炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α水平:GLP-1受体激动剂显著降低血管袖状胃切除术小鼠外周脂肪组织炎症,其拮抗剂显著提高血管外周脂肪组织炎症水平,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论GLP-1受体激动剂与拮抗剂对袖状胃切除术大鼠血管外周脂肪组织炎症以及cAMP/PKA水平均具有较强的相关性,表明GLP-1可能通过激活cAMP/PKA通路参与袖状胃切除术拮抗血管外周脂肪组织炎症。

基于PKA/CREB/GLP-1信号通路探讨加味葛根芩连汤对糖尿病db/db小鼠胰腺损伤的影响

目的观察加味葛根芩连汤对2型糖尿病db/db小鼠胰腺损伤的影响,基于PKA/CREB/GLP-1信号通路探讨其治疗糖尿病胰腺损伤的作用机制。方法将50只db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组和加味葛根芩连汤高、中、低剂量组,每组10只。另取10只m/m小鼠作为空白组。加味葛根芩连汤高、中、低剂量组分别予加味葛根芩连汤31.9、19.1、6.4 g/kg灌胃,二甲双胍组予二甲双胍0.2 g/kg灌胃,空白组和模型组予蒸馏水灌胃,连续12周。给药结束后检测小鼠空腹血糖(FBG),进行口服葡萄糖耐量试验,检测小鼠糖化血红蛋白(HbA1c)含量,TUNEL法检测胰腺组织细胞凋亡情况,RT-qPCR检测胰腺组织G蛋白偶联胆汁酸受体5(TGR5)、蛋白激酶A(PKA)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、前蛋白转化酶1/3(PC1/3)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)mRNA表达,免疫组化法检测胰腺组织TGR5、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表达,免疫荧光染色检测胰腺组织TGR5/GLP-1、神经源性分化因子1(NeuroD1)/GLP-1共表达。结果与空白组比较,模型组小鼠FBG、HbA1c含量显著升高(P<0.01),口服葡萄糖耐量显著降低;胰腺组织细胞凋亡率显著升高(P<0.01),TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1 mRNA表达显著降低(P<0.01),TGR5、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表达显著降低(P<0.01),TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,二甲双胍组和加味葛根芩连汤高、中剂量组小鼠FBG、HbA1c含量显著降低(P<0.01,P<0.05),口服葡萄糖耐量升高(P<0.01);各给药组小鼠胰腺组织细胞凋亡率显著降低(P<0.01),二甲双胍组和加味葛根芩连汤高、中剂量组小鼠胰腺组织TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1 mRNA表达显著升高(P<0.01),TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共表达显著升高(P<0.01),二甲双胍组和加味葛根芩连汤高剂量组胰腺组织TGR5、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论加味葛根芩连汤可能通过激活TGR5调节PKA/CREB/GLP-1信号通路,恢复db/db小鼠胰岛功能,改善胰腺损伤。

无机含氧酸酸性pKa_(1)的分子拓朴研究

基于中心原子的价电子数,最高主量子数,中心原子直接键连的氢原子数和非羟基氧原子数,建立了一种分子拓朴指数y.它与27种无机含氧酸酸pKa(1)的线性方程为:pKa(1)=12.7853-1.245y.结果表明,y具有良好的结构选择性和性质相关性,可用于预测其它无机含氧酸的酸性pKa(1)值.

键能/键长指数^mZ及对无机氢化物pKa_1值的预测

受Randic分子连接性拓扑指数mX的启发 ,本文构建了一种新的分子连接性拓扑指数mZ。用mZ的 0 ,1阶指数0 Z ,0 Z和 1Z ,0 Z和杨频的 ρ值分别与 p区无机氢化物的 pKa1值关联 ,拟合成 3个线性方程 ,其相关系数与相关指数分别为 0 .9938,0 .9944和 0 .9948,拓扑指数的结构选择性满足唯一性表征。预测取得了较好的结果。

复方中药白龙对G_1期人胃癌细胞中抑癌基因的影响及与PKA信号通路的相关性

目的 :探讨复方中药白龙 (简称白龙 )对人胃癌BGC82 3G1期细胞周期蛋白激酶抑制因子(CKI) p16INK4a、p2 1以及Rb、c myc等基因转录的影响和cAMP PKA信号通路的调节关系。 方法 :通过实验室常规分子生物学手段 (细胞同步化、分子杂交———Northern杂交、Western杂交等 )检测相关基因的表达变化。结果 :白龙对G1期细胞p16INK4a表达有强烈促进作用 ,mRNA和蛋白水平均显著升高 ;处理细胞的同时加入PKA抑制剂阻断该信号通路后 ,白龙作用丧失 ,p16INK4a mRNA和蛋白水平明显下降 ;白龙还可以促进抑癌基因Rb、p2 1的mRNA表达和抑制癌基因c mycmRNA的表达 ;同样在白龙作用的同时阻断该信号通路 ,则白龙的上述作用随之丧失。结论 :白龙可以通过影响BGC82 3G1期细胞中众多抑癌基因 (包括p16INK4a、p2 1、Rb)和癌基因 (包括c myc)的转录发挥其抑瘤生理效应 ,而这种变化发生的机理是与cAMP PKA信号通路的调节机制密切相关的。

PKA-CREB通路参与电针对退变椎间盘AQP1、3基因表达的影响

目的：研究电针夹脊穴对兔退变椎间盘组织中磷酸化环腺苷酸反应序列结合蛋白（p CREB）表达的影响,探讨PKA-CREB通路参与电针调控终板软骨细胞水通道蛋白1和3（AQP1、3）基因表达的作用可能机制。方法：50只健康的骨骼发育成熟的雄性新西兰大白兔,随机分为正常组、假模型组、模型组、模型＋电针组、模型＋电针＋H89组,每组各10只。采用克氏针横穿椎体后椎体间加压法复制椎间盘退变模型。电针组针刺L4、L5夹脊穴28 d。正常组和假模型组在到达造模周期后、余下3组均在造模成功后的第1天和第28天,分别各取5只行L4-5椎间盘MRI检查,然后取椎间盘组织,供酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、Western Blot、Real-time PCR检测。结果：MRI（T2加权）平扫提示电针治疗后的退变椎间盘信号较模型组增强;造模成功后,c AMP依赖性蛋白激酶A（PKA）、p CREB蛋白及AQP1、3mRNA表达均降低（P〈0.05）;电针治疗干预后可上调PKA、p CREB蛋白及AQP1、3mRNA表达水平（P〈0.05）;H89能够起到抑制PKA的表达（P〈0.05）、翻转电针上调p CREB蛋白表达的作用（P〈0.05）,AQP1、3mRNA表达水平也随之下降（P〈0.05）。结论：电针夹脊穴通过上调PKA-CREB通路的表达水平,继而增加AQP1、3mRNA的转录,促进椎间盘AQP1、3蛋白的表达,延缓椎间盘退变。

腹水草对人胃上皮细胞GES-1的保护作用及其对PKA、CREB、AQP1的调控研究

[目的]研究腹水草(Veronicastrum axillare,V.axillare)含药血清对乙醇损伤的人胃上皮细胞(gastric epithelial cells-1,GES-1)的保护作用及其对环腺苷酸依赖性激酶(protein kinase A,PKA)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP-response element binding protein,CREB)、水通道蛋白1(aquaporin 1,AQP1)表达水平的调控作用。[方法]20只雄性SD大鼠随机分为5组(n=4),连续灌胃给药14d,制备正常组(生理盐水20 m L·kg-1)、雷尼替丁组(0.027g·kg-1)以及V.axillare低、中、高剂量组(0.7、1.4、2.8 g·kg-1)含药血清。MTT法检测体外培养的GES-1细胞的活性,研究V.axillare含药血清及PKA抑制剂H-89(25μmol·m L-1)预处理对5%乙醇诱导GES-1细胞活力的影响。荧光定量RT-PCR检测PKA、CREB及AQP1 m RNA的表达水平,Western blot检测AQP1蛋白表达水平。[结果]模型组和H-89组GES-1细胞活性低于正常组,差异有统计学意义(P<0.01);乙醇造模处理显著上调PKA、CREB及下调AQP1的表达水平,差异有统计学意义(P<0.01);H-89处理显著抑制PKA和CREB m RNA表达水平(P<0.01);加入各剂量V.axillare含药血清不能显著改善H-89对PKA、CREB和AQP1 m RNA表达水平的抑制作用。V.axillare中、高剂量含药血清细胞活性高于模型组,PKA、CREB m RNA表达水平低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01),而V.axillare中、低剂量含药血清AQP1表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。[结论]V.axillare含药血清显著减轻乙醇对GES-1细胞的损伤,对GES-1细胞具有保护作用,其保护机制与下调PKA、CREB及上调AQP1的表达有关。

CRH通过CRHR1激活cAMP/PKA通路调节宫颈癌细胞的免疫逃逸和促进宫颈癌生长

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)及其受体(corticotropinreleasing hormone receptor 1,CRHR1)影响宫颈癌免疫逃逸和生长的途径。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和Western blot检测宫颈癌组织、宫颈癌细胞(HeLa细胞)和人宫颈永生化上皮细胞(H8细胞)中CRH、CRHR1、CTLA-4、IL-10和TGF-β1的表达量;用不同浓度CRH(0、1、10及20 nmol/L)作用细胞48 h或用10 nmol/L CRH作用细胞不同时间点后(12、24、36及48 h),通过CCK-8法检测各组细胞的增殖能力;CRH、CRH+CRHR1选择性阻断剂安塔拉明(CRH+Antalarmin)分别作用细胞后,RT-qPCR检测细胞CTLA-4的表达量,Western blot检测细胞中cAMP、PKA蛋白的磷酸化水平和Bax、Bcl-2、IL-10和TGF-β1表达量,CCK-8法测定细胞增殖能力;CRH、CRH+PKA通路抑制剂H-89(CRH+H-89)分别作用细胞后,RT-qPCR检测细胞CTLA-4的表达量,Western blot检测细胞中cAMP、PKA蛋白的磷酸化水平和IL-10、TGF-β1、Bax和Bcl-2表达量,CCK-8法测定细胞增殖能力。结果与癌旁正常组织和H8细胞相比,宫颈癌组织和HeLa细胞中的CRH及CRHR1表达量均显著升高(P<0.01);1、10及20 nmol/L CRH作用48 h后细胞增殖能力明显高于0 nmol/L CRH处理组(P<0.01);10 nmol/L CRH作用细胞24、36和48 h后细胞增殖能力明显高于CRH作用12 h组(P<0.01)。CRH通过CRHR1激活cAMP/PKA信号通路,促进细胞的增殖以及CTLA-4、IL-10、TGF-β1的表达。和Control组相比,CRH组细胞的CTLA-4、Bcl-2、IL-10和TGF-β1表达量升高,Bax表达量明显降低;和CRH组相比,CRH+H-89组细胞的CTLA-4、Bcl-2、IL-10和TGF-β1表达量降低,Bax表达量明显升高。结论CRH通过受体CRHR1促进宫颈癌的免疫逃逸和生长,其作用机制可能与激活cAMP/PKA通路有关。

GLP—1受体基因表达cAMP-PKA途径调控的研究

本文利用蛋白激酶A(PKA)的激活剂Forsolin对大白鼠胰岛素瘤细胞(RINm5F)上GLP一1受体的基因表达进行了研究。在forskolin的作用下,使类胰高血糖素肽I(GLP—1)受体的转水平明显下降,即GLP一1受体mRNA的量明显减少,出现了GLP一1受体基因表达的负调控,但forskoln可以使GLP—1受体的mRNA的稳定性增加结果表明,GLP—1受体的转录是通过cAMP—蛋白激酶A途径进行调控的,因此,影响此途径的物质对类胰高血糖素肽—1的生理功能以及在临床应用方面起着重要作用。

蛋白激酶A在转化生长因子-β_(1)刺激增生性瘢痕成纤维细胞增殖中的作用

目的 :探讨蛋白激酶 A在转化生长因子 - β1 (TGF-β1 )刺激增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞 (HS- FB和 NS-FB)增殖中的信号转导作用。 方法 :利用 32 P掺入底物法测定HS- FB和 NS- FB的 PKA活性 ;使用直接计数法和 MTT法测定 TGF-β1 和 c AMP、H7等刺激两种细胞后增殖能力的变化。 结果 :NS- FB被 TGF-β1 刺激后 PKA的活性短暂升高后很快恢复 (30 m in内 ,但 P>0 .0 5 ) ,HS- FB则在 30～ 6 0 min降低(P<0 .0 5 ) ,1h后恢复 ;HS- FB的 PKA活性比 NS- FB低 (但P >0 .0 5 )。 TGF-β1 能强烈刺激两种细胞增殖 (30 min后 P<0 .0 5 ) ,对 HS- FB的刺激作用更强 (刺激 6 0 m in后 P<0 .0 5 )。c AMP可抑制两种细胞增殖 (6 0 m in后 P<0 .0 5 ) ,H7有拟 TGF-β1 作用 (30 min后 P<0 .0 5 ) ,H7还可增强 TGF-β1 的刺激作用 (30～ 6 0 min后 P<0 .0 5 )。 结论 :TGF-β1 刺激后 PKA的活性在两种细胞有不同的变化 ,提示两种细胞的 c AMP/ PKA信号通道存在一定的差异 ;TGF-β1 刺激作用部分经 PKA活性变化介导 ,但活化 PKA通道可以逆转 TGF-β1 的作用。

EP2受体介导的前列腺素E_2影响胆管细胞癌细胞HuCCT1细胞间黏附因子-1表达和侵袭的研究

目的 :探讨前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)通过EP2受体影响人胆管细胞癌细胞HuCCT1细胞间黏附因子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达及癌细胞的侵袭能力。方法:用PGE2、EP1～4四种受体激动剂(17-phenyltrinorProstaglandin E2、Butaprost、Sulprostone和Prostaglandin E1 Alcohol)、EP2受体抑制剂AH6809、腺苷酸环化酶(AC)抑制剂SQ22536和蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89处理HuCCT1细胞,通过Western blot、划痕试验等方法检测ICAM-1的蛋白表达水平以及HuCCT1细胞侵袭能力的变化。结果:PGE2明显提高HuCCT1细胞ICAM-1蛋白的表达水平,5μmol/L PGE2处理HuCCT1细胞24 h后,ICAM-1蛋白表达水平与对照组相比上升了66.17%(P<0.05),并呈浓度依赖性和时间依赖性;5μmol/L PGE2处理HuCCT1细胞24 h后,HuCCT1细胞的侵袭能力较对照组增强了43.29%(P<0.01)。10μmol/L EP1～4受体激动剂处理HuCCT1细胞24 h后,ICAM-1蛋白的表达水平与对照组相比明显增高,其中EP2受体激动剂上升了257.88%(P<0.05),10μmol/L EP2受体激动剂处理HuCCT1细胞24 h后,HuCCT1细胞的侵袭能力较对照组增强了56.99%(P<0.01);10μmol/LEP2受体抑制剂AH6809处理后ICAM-1蛋白的表达水平与PGE2组相比下降了49.14%(P<0.05),细胞侵袭能力下降了52.06%(P<0.01)。25μmol/L AC抑制剂SQ22536、10μmol/L PKA抑制剂H89处理HuCCT1细胞后,ICAM-1蛋白的表达水平较EP2受体激动剂处理组分别下降了72.87%(P<0.05)和80.78%(P<0.05)。结论:PGE2可通过EP2受体激活cAMP-PKA信号转导通路上调HuCCT1细胞ICAM-1的表达,从而促进HuCCT1细胞的侵袭转移。

高浓度的staurosporine aglycone激活大鼠肺动脉平滑肌细胞中的ERK1／2

目的有报道表明staurosporine作为一种蛋白激酶C（PKC）的抑制剂，可以在多种细胞系内调节细胞外信号调节激酶（ERK1／2）的活性，但是它的衍生物staurosporineagly—COfle（SA）是否具有相同的作用还不清楚，本次实验旨在阐明其对ERK1／2活性的调节作用。方法培养至4～8代的大鼠肺动脉平滑肌细胞，经过SA处理后提取细胞蛋白，应用Westernblot方法检测磷酸化ERK1／2的含量，观察不同浓度和时间点的SA对ERK1／2活性的影响。结果在纳摩尔浓度水平的SA可以降低大鼠肺动脉平滑肌细胞中ERK1／2的磷酸化水平，但是30μmol·L-1的SA可以激活ERK1／2，这种激活作用可以被丝裂素活化蛋白激酶的激酶（MEK）的抑制剂PD98059或蛋白激酶A（PKA）的激活剂异丙肾上腺素（isoproteren01）所抑制。结论sA对肺动脉平滑肌细胞中的ERK1／2活性有双向调节作用，这种作用是通过PKC和（或）PKA通路产生的。

3-异丁基-1-甲基黄嘌呤对低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的Ca^(2+)/cAMP不依赖性保护作用

目的 观察 3 异丁基 1 甲基黄嘌呤 ( 3 Isobutyl 1 methylxanthine ,IBMX)对 5mmol·L-1KCl诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的拮抗作用并探讨其与 [cAMP]i和Ca2 +的关系。方法 建立KCl 5mmol·L-1诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型 ,用荧光二酯素法分析神经元存活 ,Hoechest332 5 8核染色和DNA琼脂糖凝胶电泳分析凋亡 ,放射免疫法测定cAMP浓度。结果 IBMX呈浓度依赖性拮抗 5mmol·L-1KCl诱导的神经元死亡 ,并明显减少核形态异常的神经元 ,使DNA电泳梯带变浅或完全消失 ;IBMX( 1.0mmol·L-1)可持续升高神经元 [cAMP]i,福司可林 2 .0 μmol·L-1升高 [cAMP]i作用与IBMX类似 ,但不能模拟IBMX的作用 ;此外 ,IBMX的拮抗作用不被cAMP竞争性抑制剂Rp cAMP和PKA的特异阻断药H 89阻断 ;单用或联用钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ的特异抑制剂KN 93和磷酯酰肌醇 3位羟基激酶的特异性抑制剂LY2 940 0 2也不能阻断。结论IBMX抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡作用不依赖cAMP和Ca2 +。

二肽酰肽酶-4抑制剂通过PKA/NF-κB信号通路调节LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的实验研究

目的探讨二肽酰肽酶-4(DPP-4)竞争性抑制剂沙格列汀对LPS诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)炎症反应的调节作用及相关的分子机制。方法将RAW264.7细胞分为4组,分别为对照组(Control组)、LPS组、LPS+沙格列汀(LPS+SAX组)和LPS+沙格列汀+PKA抑制剂H-89组(LPS+SAX+H-89组)。在干预6小时后使用qPCR法和western blot法对细胞ICAM-1mRNA和蛋白的表达水平进行检测;并采用western blot法对细胞PKA和NF-κB p65活化水平进行分析。结果与Control组相比较,在LPS干预6小时后RAW264.7细胞ICAM-1mRNA和蛋白的表达水平及NF-κB p65活化水平均明显上升,而PKA活化水平明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.05);但LPS组较LPS+SAX组ICAM-1表达和NF-κB p65活化水平的增加更明显,而PKA活化下降更加明显,差异均有统计学意义(P均<0.05)。同时发现在LPS诱导状态下沙格列汀对于ICAM-1表达和NF-κB p65活化水平的抑制作用和PKA活化水平的促进作用可被PKA抑制剂H-89显著拮抗,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论本研究显示DPP-4抑制剂可以通过调控PKA/NF-κB信号通路下调LPS诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的炎症反应,为DPP-4抑制剂应用于炎症性疾病的治疗奠定了初步的理论基础。

小分子化合物毛喉素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导骨髓间充质干细胞分化为许旺细胞样表型的可能性

背景:周围神经损伤是一种主要由创伤等因素引起的临床常见疾病,研究表明,由骨髓间充质干细胞转分化的许旺细胞可以促进周围神经损伤的修复与重建,但其诱导方法尚未达成共识,并且细胞神经转分化的机制仍尚不明确。目的:探讨小分子化合物(毛喉素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)诱导骨髓间充质干细胞分化为许旺细胞的可行性,以及该诱导过程与cAMP/PKA通路的相关性。方法:采用全骨髓贴壁法从1周龄SD乳鼠四肢骨骨髓中提取出原代骨髓间充质干细胞,运用细胞免疫荧光对其进行鉴定,并用CCK-8法检测各代骨髓间充质干细胞在不同培养时间点的增殖活性变化,以小分子化合物对骨髓间充质干细胞进行体外诱导分化,实验分为3组:对照组用神经生长培养基处理120 h、诱导组用神经生长培养基+毛喉素+3-异丁基-1-甲基黄嘌呤处理120 h、抑制组用神经生长培养基+毛喉素+3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+cAMP抑制剂SQ22536处理120 h,每60 h更换1次培养基。通过细胞形态学、Western blot等技术对许旺细胞样细胞进行鉴定及相关分析,同时检测分化过程中cAMP相关蛋白的表达。结果与结论:①细胞免疫荧光染色显示分离培养的原代细胞能够被CD44和CD90标记,CCK-8结果显示在相同培养时间点,第1-3代骨髓间充质干细胞增殖活性逐渐增加,第3-6代骨髓间充质干细胞增殖活性逐渐降低;②Western blot结果显示小分子化合物诱导后许旺细胞特异性标志物S100β、GFAP和p75以及cAMP相关蛋白p-CREB表达均明显增加(P<0.001;P<0.001;P<0.05;P<0.0001),而cAMP/PKA抑制剂SQ22536可以抑制这一效应(P<0.01;P<0.01;P<0.05;P<0.001);③结果表明,该小分子化合物可以诱导骨髓间充质干细胞分化为许旺细胞表型,并且诱导过程中可能激活了cAMP/PKA通路。

CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞PKA C-α的研究

利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。

TNF-α在食管鳞癌细胞中对PD-L1表达的影响

目的探讨TNF-α在食管鳞癌细胞株Eca109中对PD-L1表达的影响以及PKA/CREB在TNF-α调节PD-L1表达中的作用。方法体外培养食管鳞状细胞癌Eca109细胞,实验分为空白对照组、TNF-α组(20 ng/ml TNF-α诱导24 h)和TNF-α+Staurosporine组(先20 ng/ml Staurosporine作用15 min,再加入20 ng/ml TNF-α诱导24 h)。应用qRT-PCR检测PD-L1 mRNA水平,应用免疫荧光染色观察PD-L1的表达情况,应用Western blot检测PD-L1、p-CREB和PKA的蛋白表达水平。结果qRT-PCR、免疫荧光染色和Western blot检测结果显示,与空白对照组比较,TNF-α组中PD-L1 mRNA和蛋白水平的表达升高(P<0.05);与TNF-α组比较,TNF-α+Staurosporine组PD-L1 mRNA表达降低(P<0.05),PD-L1、p-CREB和PKA蛋白表达降低(P<0.05)。结论TNF-α能够促进食管鳞癌细胞株Eca109中PD-L1的表达,TNF-α对PD-L1的调节可能与PKA-CREB有关。

PGE_(2)通过EP4/PKA信号通路调控滑膜细胞OAT1的表达及CP-25的作用

目的明确前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE_(2))对滑膜细胞有机阴离子转运体1(organic anion transporter 1,OAT1)膜表达的调控机制及芍药苷-6'-O-苯磺酸酯(CP-25)的作用。方法免疫荧光法检测不同浓度CP-25对PGE_(2)处理后滑膜细胞OAT1和前列腺素E受体4(prostaglandin E receptor 4,EP4)表达的影响;使用EP4激动剂(TCS2510)与拮抗剂(GW627368X),探究EP4在OAT1调节中的作用;使用CP-25和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89,探究CP-25和PKA对滑膜细胞OAT1表达的影响。结果PGE_(2)在0~10 min内明显下调EP4与OAT1的膜表达,20~60 min后明显上调(P<0.05);CP-25明显上调PGE_(2)处理后细胞膜OAT1和EP4的表达(P<0.05);EP4激动剂TCS2510明显上调细胞膜OAT1的表达(P<0.01);CP-25上调PGE_(2)处理的细胞中OAT1的表达,GW627368X和H-89均能下调PGE_(2)和CP-25处理的滑膜细胞中OAT1的表达(P<0.01)。结论PGE_(2)介导的EP4/PKA信号通路可以调控OAT1在滑膜细胞膜上的表达,CP-25可以通过活化EP4/PKA信号通路明显上调滑膜细胞中OAT1的膜表达。