可回复性永生化逆转录病毒载体pLNCTIGIox的构建与表达

目的:为建立可回复性永生化肝细胞株,构建带有筛选基因NeoR、报道基因EGFP及重组位点loxP的可回复性永生化逆转录病毒载体.方法:将2.1kbSV40T亚克隆到pIRES2-EGFP的相应位点,再酶切下3.4kbSV40T-IRES-EGFP片段插入逆转录病毒载体pLNCX2的两个相同酶切位点之间,构成新载体pLNCTIG.最后,将线性化pLNCTIG和loxP双链片段混合连接.取连接产物转化高效感受态DH5α细胞.菌落PCR和酶切法鉴定阳性克隆.转染包装细胞PT67并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.扩大培养稳定转染的细胞,免疫组化染色检测SV40T基因的表达.结果:随机挑取19个克隆,3个电泳分离出约1.1kb阳性条带.取上述阳性克隆进行酶切鉴定,结果仅出现一条约9.5kb的条带,证明该克隆为阳性重组体.转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光.免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色.结论:成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pLNCTIGlox.