重组人干扰素α2b对病毒性肺炎患儿临床症状体征、外周血免疫细胞的影响

以临床症状体征、肺功能指标、外周血免疫细胞、不良反应为依据,分析重组人干扰素α2b治疗病毒性肺炎患儿的影响。方法 选择锡林郭勒盟中心医院2019年6月至2023年5月期间收治的病例78例,均为病毒性肺炎患儿,共分为三组均26例,分别为对照组、L组、H组,分组方式为随机对照法。常规治疗予以对照组。L组H组均在常规础上行低剂量为10万U/(kg·次)重组人干扰素α2b雾化吸入,及高剂量为20万U/(kg·次)。治疗时间三组均为连续1周+观察1周。比较其临床症状体征消退时间、肺功能指标、外周血免疫细胞水平、不良反应。结果 三组各项临床症状体征消退时间相比,L组、H组均短于对照组,H组短于L组;与治疗前相比,治疗后三组峰值呼气流速(PEF)、达峰容积比(VPTEE/VE)、每公斤潮气量(VT/kg)、1秒用力呼吸容积(FEV1)、CD4+、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)均呈上升态势,且三组间比较有意义,其中L组、H组均高于对照组,H组高于L组;治疗后三组CD8+水平均呈下降态势,且三组间比较有差异,其中L组、H组均低于对照组,H组低于L组;P<0.05。治疗期间三组不良反应发生率相比无意义,P>0.05。结论 重组人干扰素α2b用于小儿病毒性肺炎治疗中可促进患儿相关症状体征缓解,并实现对其免疫功能及肺功能的有效改善,用药安全性高,用药剂量高时疗效更为显著。

pLNCX-pemt2重组载体的构建及pemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究 pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型 ,构建了p LNCX- pemt2重组体 .将目的基因 pemt2连接入含有 neo抗性基因的真核细胞表达载体 p LNCX中 ,构建 p LNCX- pemt2重组子 ,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌 CBRH- 791 9细胞中 ,应用PCR、Western印迹及 [3 H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定 .转染 p LNCX- pemt2的大鼠肝癌细胞 ,PEMT2成功表达 (分子量为 2 2 .5k D) ;高表达克隆 PEMT2的表达量比对照组高约 5倍 ,其活性比对照组高 2 .1倍 ;细胞生长的倍增时间从 2 1 .54± 7.0 8h延长到 43.2 2± 7.1 1h.结果表明 ,p LNCX- pemt2重组体转入肝癌细胞后 ,PEMT2蛋白得到高效表达 ,明显抑制肝癌细胞生长 .

含重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人骨形态发生蛋白-2骨水泥在骨质疏松性腰椎压缩性骨折治疗的应用价值

目的:探讨含重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF)和重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)骨水泥在骨质疏松性腰椎压缩性骨折(osteoporotic vertebral compression fracture,OVCF)患者经皮椎体后凸成形术(percutaneous kyphoplasty,PKP)治疗的应用价值。方法:回顾性分析2018年1月至2021年1月收治的103例行PKP手术治疗的OVCF患者,男40例,女63例;年龄61~78(65.72±3.29)岁。受伤原因:滑倒33例,跌倒42例,提重物受伤28例。根据填充骨水泥不同分为3组:磷酸钙组34例,男14例,女20例,年龄(65.1±3.3)岁,填充磷酸钙骨水泥;rhBMP-2组34例,男12例,女22例,年龄(64.8±3.2)岁,填充含rhBMP-2的骨水泥;rhbFGF+rhBMP-2组35例,男14例,女21例,年龄(65.1±3.6)岁,填充含rhbFGF和rhBMP-2的骨水泥。比较3组Oswestry功能障碍指数(Oswestry dysfunction index,ODI)、骨密度、椎体前缘丢失高度、伤椎前缘压缩率、疼痛视觉模拟评分(visual simulation score,VAS)及再骨折发生率。结果:所有患者获得12个月随访。3组术后ODI、VAS呈下降(P<0.001),骨密度增高(P<0.001),椎体前缘丢失高度、伤椎前缘压缩率呈先下降后缓慢上升趋势(P<0.001),rhbFGF+rhBMP-2组术后第1、6、12个月ODI、VAS均低于rhBMP-2组和磷酸钙组(P<0.05),术后第6、12个月骨密度大于rhBMP-2组和磷酸钙组(P<0.05)。rhbFGF+rhBMP-2组术后第6、12个月椎体前缘丢失高度、伤椎前缘压缩率均低于rhBMP-2组和磷酸钙组(P<0.05)。3组再骨折发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:含rhbFGF和rhBMP-2骨水泥可更有效地增加OVCF患者骨密度,获得术后满意的临床和放射学效果,显著改善临床症状。

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法 根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR I、Not I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的 :构建人骨形态发生蛋白 2 (humanbonemorphogeneticprotein ,hBMP 2 )真核表达载体PcDNA3 1 hBMP 2 ,转染兔骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs) ,种植去抗原牛松质骨(bovinecancellousbone ,BCB)支架体外构建组织工程骨。方法 :蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达 ,碱性磷酸酶 (ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 :转染后 ,BMSCs表达BMP 2 ,ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论 :在脂质体介导下 ,BMP 2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化 ,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好 ,为进一步应用携带BMP

重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白体外活性评价方法研究

为建立稳定、便捷的重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白(rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白,重组融合蛋白)体外活性评价方法,本研究分别采用ChIFN-α和ChIL-2ELISA方法检测重组融合蛋白与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性;采用细胞病变抑制法检测重组融合蛋白在DF1细胞上抑制水疱性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)增殖活性;采用MTS法分别测定重组融合蛋白促鸡外周血T淋巴细胞(PBLC)和脾淋巴细胞增殖活性。结果表明,重组融合蛋白可以与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应;重组融合蛋白在DF1细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV活性高于抗IBDV活性,且均明显高于rChIFN-α蛋白对照;不同浓度的重组融合蛋白均具有明显的促鸡PBLC和脾淋巴细胞增殖活性,且其促增殖活性明显高于rChIFN-α蛋白对照。本研究成功建立了重组融合蛋白体外活性检测评价方法,为进一步探究重组融合蛋白在鸡体内协同作用奠定基础。

人重组磷脂酶D_2变构体cDNA和蛋白质序列分析

采用VectorNTI、DNATools等计算机分析软件及信息库 ,研究人重组磷脂酶D2 (rhPLD2 )变构体的生物学特征。rhPLD2具有多种基因结构和功能调控元件 ,其编码的蛋白质具有发挥功能所必需的活性保守基序和一定的空间结构 ,表明rhPLD2应是一种具有一定生物学功能的异质性蛋白质。

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。 方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。 结果 从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。 结论 成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。

重组钩体基因疫苗免疫豚鼠脾细胞LTT,IL-2,IL-6的活性测定

目的 为从多方面证实赖型钩体重组基因疫苗的免疫活性。方法 将赖型钩体重组基因多肽疫苗 (分子量6 8k Da)多点皮下注射免疫豚鼠。(以质粒载体 p T7- 7为阴性对照 ,全钩死疫苗 WCV为阳性对照 )取其脾细胞 ,用 3H- Td R法和MTT比色法分别测定特异性淋巴细胞转化试验 (L TT)的相对转化指数 (RPI)及 IL - 2 ,IL - 6活性。结果 1)重组基因疫苗免疫组特异性 L TT的 RPI为 2 .19± 0 .18明显高于 p T7- 7阴性对照 1.42± 0 .2 7(P<0 .0 0 5 ) ,与阳性对照 WCV无统计学差异 (P>0 .0 5 )。2 )基因疫苗免疫组 IL - 2 ,IL - 6活性分别为 34.8± 3.11,94.6± 6 .0 2测定值明显高于 p T7- 7阴性对照 2 0 .4± 3.0 5 ,6 1±6 .2 8(P<0 .0 0 5 ) ,与 WCV阳性对照无统计学差异 (P>0 .0 5 )。结论 1)钩体基因重组疫苗能使免疫豚鼠体内 Th1 、Th2 活化增强 ,有胸腺依赖性抗原性质 (TDAg) ,可激起体内强有力 T- B细胞协同效应的特异性体液免疫反应 ,确有增强免疫活性作用 ,是良好的免疫原。2 )重组钩体基因疫苗与阳性对照 WCV各实验值无统计学差异 ,提示二者免疫活动可能相当 ,但重组基因疫苗有毒副作用小的优势 。

表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测

从ConA刺激的鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素 2 (ChIL 2 )基因编码区。将该编码区cDNA序列和调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子 (PE L)的基因片段定向克隆到鸡痘病毒转移载体p1175中 ,获得重组转移载体p1175IL2 ,然后转染已感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株 (wt FPV)的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,质粒p1175IL2与wt FPV基因组DNA发生同源重组 ,产生了表达ChIL 2的重组鸡痘病毒rFPV IL2。通过在含X gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑 ,获得并纯化重组鸡痘病毒rFPV IL2。应用XTT PMS方法检测的rFPV IL2 (M .O .I 2 0 )感染CEF 72小时后细胞上清中表达的重组ChIL 2生物活性 ,效价为 3 6× 10 5u mL ,表明rFPV IL2能有效地表达ChIL 2。下一步将利用rFPV IL2在体内表达ChIL 2 ,研究ChIL 2的免疫增强作用及其作用机理。

MBD2靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的 本研究利用RNA干扰 (RNAinterfering ,RNAi)技术 ,以MBD2 (methylCpG bindingdomain 2 )为靶基因 ,设计构建重组体 ,并进行序列分析 ,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法 设计有小发夹结构的两条DNA序列 ,经退火成互补双链 ,再克隆至载体 pTZU6 +1中构建重组体 ,转化JM1 0 9菌株 ,提取质粒行酶切鉴定后 ,进行测序分析。 结果 将合成的DNA序列退火后克隆到载体上 ,经测序鉴定确实为所需序列。结论 MBD2靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析 ,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中MBD2的mRNA转录 。

聚乙二醇修饰重组人IFNα_(2b)体外理化性质的初步研究

目的 分析聚乙二醇（PEG）化学修饰重组人IFNα2b（PEC-IFNα2b）的体外理化性质,并与修饰前IFNα2b进行比较。方法 将IFNα2b与PEG-IFNα2b进行胰酶消化和56℃保温实验,不同时间取样测其抗病毒活性。IFNα2b的抗体与IFNα2b和PEG-IFNα2b做双相琼脂扩散。结果 修饰后的IFNα2b的抗胰蛋白酶降解及抗热能力均明显优于未修饰的IFNα2b,抗原性亦明显下降。结论 对PEG-IFNα2b的体外理化性质进行初步分析,为研究和开发长效干扰素提供理论依据。

体外评价抗生素对人重组骨形成蛋白-2诱骨活性的影响

目的研究抗生素对骨形成蛋白诱骨活性的影响。方法以人骨髓成骨细胞为作用细胞,选用合适剂量的人重组骨形成蛋白-2(rhBMP-2m)为作用底物,分别加入不同浓度的替硝唑(Tinidazole,TNZ)、克拉霉素(Clarithromycin,CLM),以及二者的混合物进行体外培养,96h后观察细胞生长情况,MTT法测定细胞活力,并检测定细胞内碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)活性。结果(1)高剂量(≥1000μg/ml)的克拉霉素对人骨髓成骨细胞的增殖具有轻微的抑制作用,而高剂量的替硝唑则有一定的细胞毒性,较多的细胞漂浮,裂解为碎片;联合用药对细胞增殖的影响与替硝唑剂量成正比。(2)药物对碱性磷酸酶活性的影响,同细胞的增殖程度成正相关,剂量小于1000μg/ml时对酶活性无影响。结论局部应用克拉霉素和替硝唑应选用小于1000μg/ml的药物浓度为宜;两抗生素对BMP的诱骨活性并不产生直接的影响,而是由于对细胞增殖的抑制作用间接影响了碱性磷酸酶的活性。

含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒重组体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒。方法:将抗凋亡基因bcl-2片段从载体pcDNA3.1中切下,定向插入逆转录病毒载体PLNCX2中,酶切鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定表达bcl-2的细胞株。结果:双酶切鉴定,成功构建重组逆转录病毒载体;重组逆转录病毒转入包装细胞PT67,经G418筛选,形成了抗性克隆,并测得病毒滴度为3×1011cfu/L,提示构建的含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论:含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒载体构建成功。

重组人β2糖蛋白1第一结构域二聚体作为抗磷脂抗体综合征B细胞耐受原的初步探讨

目的:探讨重组人β2糖蛋白1第一结构域二聚体(rhβ2-GP1-DⅠ2)对重组人β2糖蛋白1(rhβ2-GP1)免疫小鼠β2-GP1特异性B细胞反应的抑制作用。方法:应用固相ELISA方法,检测静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2后免疫小鼠产生的抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2-GP1)滴度及anti-β2-GP1产生水平比率;应用ELISPOT方法,检测静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2后免疫小鼠脾脏β2-GP1特异性抗体形成细胞(AFC)数量。结果:静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2后,与对照组比较,rhβ2-GP1免疫小鼠βanti-β2-GP1滴度明显降低(P<0.01),anti-β2-GP1产生水平比率下降,β2-GP1特异性AFC数量明显减少(P<0.01)。结论:静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2能够抑制rhβ2-GP1免疫小鼠β2-GP1特异性B细胞的反应能力。

重组鼠IL-1β和/或慢性缺氧刺激对大鼠颈动脉体中p-ERK1/2表达的影响

目的:观察慢性低压性缺氧和重组鼠白介素-1β(rmIL-1β)刺激对大鼠颈动脉体(carotid body,CB)中磷酸化细胞外信号调节蛋白激1/2(p-ERK1/2)表达的影响。方法:雄性SD大鼠分为8组,分别为缺氧刺激0、1、2、3周组和缺氧0、1、2、3周的同时伴rmIL-1β刺激组。对CB进行免疫组化染色,并用Western Blot法对p-ERK1/2进行半定量分析。结果:相对于缺氧0周组,缺氧2周和缺氧3周组大鼠CB中p-ERK1/2的含量明显增加。相对于单纯给予缺氧,缺氧同时给予rmIL-1β刺激后引起大鼠CB体中p-ERK1/2表达量的增加。结论:慢性缺氧和rmIL-1β刺激均可致颈动脉体p-ERK1/2上调;慢性缺氧伴rmIL-1β刺激比单纯缺氧或rmIL-1β刺激可引起p-ERK1/2更显著的增加。

人TIMP-2基因逆转录病毒重组体的构建及表达

目的:构建含人TIMP-2基因可调控逆转录病毒重组体。方法:通过四步亚克隆将编码人组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)的基因片段从表达载体Blueseript中切下,定向插入经改良的逆转录病毒载体pL-MT上,以限制性内切酶鉴定插入方向是否正确。结果:限制性内切酶谱分析与理论计算相等。结论:含人组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-2基因可调控逆转录病毒重组体构建成功,为体外胶原代谢的基因调控研究提供了新的途径。

反向PCR扩增问号赖型钩体重组质粒pDJH_2插入片段

钩端螺旋体赖型赖株（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓＳｅｒｏｖａｒｌａｉ）ＤＮＡ分别经ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ３种内切酶酶切完全消化，通过设计１对引物，反向ＰＣＲ扩增问号赖型钩体重组质粒ｐＤＪＨ２插入片段两端的未知序列．结果显示不同酶切环化连接，经反向ＰＣＲ扩增均可得２条大小相等的扩增带．结果提示反向ＰＣＲ技术可以用于问号赖型钩体重组质粒插入片段两端的未知序列的研究，为获得钩体完整基因序列提供新的途径．

携带小鼠白细胞介素-12 siRNA基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建载有白细胞介素-12干扰RNA(IL-12si RNA)基因的,能在树突状细胞(DC)表达的重组腺病毒载体,为免疫耐受提供基础。方法:将IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle2,得到重组质粒,并与腺病毒骨架质粒BD Adeno-XTM体外连接后代共转化大肠杆菌DH5α菌株,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装扩增及氯化铯(CsCl)纯化,生成带有IL-12p35和IL-12p40si RNA基因的重组腺病毒载体,感染DC细胞。结果:经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应(PCR)和逆转录(RT)等方法的鉴定,证实了载体构建的正确性;经测定,病毒滴度为2.5×1010efu/ml。结论:成功构建带有IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA的重组腺病毒载体,其所携带的载体能够转染小鼠DC并干扰其在DC中表达,为进一步的研究奠定了基础。