日本血吸虫卵黄铁蛋白基因的体外扩增及逆转录病毒pLXSN-Fer1重组质粒的构建

目的 构建日本血吸虫ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 真核表达重组逆转录病毒，为进一步在细胞中表达及ＤＮＡ免疫作准备。方法 用ＰＣＲ技术从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库中扩增编码卵黄铁蛋白（ｙｏｌｋ ｆｅｒｒｉｔｉｎ，Ｆｅｒｌ） 的基因片段，定向克隆入ｐＬＸＳＮ 逆转录病毒载体，然后经氨苄ＬＢ培养基筛选，酶切、ＰＣＲ鉴定。结果 从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库中扩增出特异的卵黄铁蛋白的基因片段，克隆成功ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 重组逆转录病毒。结论 构建成功ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 重组逆转录病毒。

pLXSN-HPVL2-Angiostatin的构建及转染T细胞淋巴瘤细胞系的体外杀伤活性研究

目的 探讨人乳头瘤病毒 (HPV)感染相关疾病既具靶向性又能阻断局部血管生长的基因治疗新途径。方法 将血管生长抑制因子 (angiostatin)及HPV抗原基因同时克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN ,用PA3 17细胞包装、筛选 ,建立高滴度的感染性重组病毒产生细胞系 ,以重组病毒转染T细胞淋巴瘤Hut 78细胞系 ,在体外观察其对HPV感染阳性宫颈癌细胞的杀伤活性。结果 PCR及RT PCR检测显示获得了 pLXSN HPVL2 Angiostatin ,并成功转染Hut 78细胞系 ,镜下观察及MTT检测 ,显示了其对HPV阳性宫颈癌细胞的特异趋向及高杀伤活性。结论 pLXSN HPVL2 An giostatin及其成功转染的Hut

应用逆转录病毒pLXSN-EGFP示踪观察电针任脉对MCAO大鼠SVZ区NSC增殖的影响

目的:利用侧脑室注射pLXSN-EGFP在体示踪观察电针任脉对缺血侧SVZ区NSC增殖的情况,探讨电针任脉治疗缺血性脑损伤的作用机制。方法:将病毒上清注入MCAO大鼠侧脑室以标记新增殖细胞,并用Nestin免疫荧光染色法鉴定NSC,并计数不同时相缺血侧SVZ区NSC。结果:脑缺血后不同时相缺血侧SVZ区均有新增殖NSC,且电针任脉组有更明显的增加。结论:缺血可激发SVZ区NSC的增殖,电针任脉可起到明显促进作用,推论这种作用可能是是任脉的妊养和促进脑缺血后神经修复功能的重要机制。

pLXSN-MICA~＊ 008和pLXSN-MICA~＊ 001在人成纤维细胞表达

目的:建立表达MICA* 008和MICA* 001蛋白的人包皮成纤维(human foreskin fibroblast,HFF)细胞,为研究MICA基因的免疫功能提供生物学材料。方法:组织块法原代培养HFF细胞;用脂质体将质粒pLXSN,pLXSN-MICA* 008和pLXSN-MICA* 001转染PA317包装细胞后收集病毒颗粒,再将病毒颗粒感染HFF细胞,G418筛选14天,扩增耐药细胞,westernblot检测MICA* 008和MICA* 001蛋白表达情况。结果:逆转录病毒载体pLXSN,pLXSN-MICA* 008和pLXSN-MICA* 001经包装细胞PA317包装可产生有感染能力的病毒,该病毒感染HFF细胞后,westernblot检测出外源蛋白MICA* 008和MICA* 001。结论:建立了表达MICA* 008和MICA* 001蛋白的人成纤维细胞。

pLXSN-EGFP逆转录病毒载体的构建及体内外表达的研究

目的构建携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒载体,观察该报告基因在动物体内外表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。方法以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN获得重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后收集具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP作为报告基因在体内外的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。结果成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并在体内外稳定表达,对靶细胞及其所成肿瘤的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30.7%细胞表达GFP。结论该载体可在体内外成功表达,对靶细胞的生长无明显抑制,高表达GFP的靶细胞有一定形态上的变化;使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低。

构建降钙素基因相关肽真核表达质粒pLXSN—CGRP

降钙素基因相关肽（CGRP）是目前体内最强的扩血管物质，对心脑血管有很强的扩张作用。pLXSN载体是一种高效的真核表达载体。我们将大鼠CGRPcDNA插入到多克隆位点，构建重组真核表达载体pLXSN—CGRP。

转导野生型p53的K562细胞出现生长抑制和凋亡

把重组有编码野生型p53的逆转录病毒载体转导到p53蛋白缺失的K562细胞,以观察野生型p53蛋白在K562细胞表达后对K562细胞增殖和凋亡的影响。应用RT-PCR和Western印迹杂交方法检测K562细胞p53表达,应用流式细胞仪计数检测细胞的增殖,采用梯形DNA和细胞形态学方法检测细胞凋亡变化。研究结果表明:感染pLXSN-p53病毒24小时后,K562细胞p53表达阳性,K562-p53细胞的生长受到抑制,少数细胞进入凋亡状态。结论提示,野生型p53可促进p53表达阴性的K562细胞生长抑制与凋亡。

人Tum-5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的构建携带Tum-5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系。方法采用RT-PCR法从胎肾组织中扩增Tum-5基因片断,并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定。利用电穿孔方法将获得的重组质粒转染PA317细胞,经G418筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果PCR、酶切证实Tum-5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN,Tum-5基因测序结果和原始序列相同。重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,RT-PCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum-5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/m。l结论成功的构建了携带人Tum-5基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系。

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的 构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果 酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论 成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。

不同启动子对癌胚抗原DNA疫苗在小鼠体内表达CEA及诱导体液免疫的影响

目的比较含不同启动子的癌胚抗原DNA疫苗pCEA和pLCEASN在小鼠体内表达CEA及诱导体液免疫的差别。方法将7天前肌肉注射0.75%布比卡因的小鼠分成4组,每组5只,分别将含不同启动子的重组质粒pCEA、pLCEASN及阴性对照质粒pcDNA3、pLXSN注射于小鼠的舌肌内,每周1次,每次100/μg,共5次;最后1次注射7天后,眼球内眦静脉取血测抗-CEA滴度,处死小鼠并取其舌用放免法测其CEA的含量。结果用pLCEASN和pCEA质粒DNA免疫的小鼠舌肌的CEA含量(ng/mg舌肌)分别为1.85±0.11和2.48±0.09(P<0.001),血清(1:200稀释)抗-CEA滴度(OD490)分别为0.42±0.04和0.59±0.06(P <0.001)。结论启动子对癌胚抗原DNA疫苗在小鼠体内表达CEA及诱导体液免疫方面具有重要作用。

携带钙整合素结合蛋白基因逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞系的建立

目的:构建钙整合素结合蛋白(CIB)的逆转录病毒表达载体,并建立包装细胞系。方法:质粒pet32-CIB经EcoRI和XhoI双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB,PCR及双酶切鉴定后,通过脂质体转染导入包装细胞pA317,G418稳定筛选后获得抗性克隆,NIH3T3细胞进行逆转录病毒颗粒滴度测定。结果:重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB质粒测序结果与GenBank中序列一致,经PCR及酶切鉴定证实,获得了大约574bp的基因片段,且正确插入pLXSN-CIB载体中;建立了pA317-CIB包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度为6.81×105CFU/mL。结论:pLXSN-CIB结构正确,成功构建了CIB基因的逆转录病毒表达载体并建立了pLXSN-CIB包装细胞系。

萤火虫荧光素酶报告基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建含萤火虫荧光素酶报告基因的逆转录病毒载体,为进一步研究生物发光活体动物体内光学成像奠定基础。方法利用重组DNA技术,将荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic双酶切得到的目的基因fluc+亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(fluc)SN在脂质体介导下"乒乓"转染GP+E86和PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。扩大培养,测定病毒滴度,并检测荧光素酶活性。结果经限制性酶切分析鉴定,载体插入基因大小、位置均正确,并用GP+E86和PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的重组逆转录病毒fluc细胞系,该细胞可高效表达荧光素酶。结论成功构建了重组质粒pL(fluc)SN,为标识干细胞进行基础研究提供了一种检测方法和平台。

携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。【方法】以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点(MCS)的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况、以及对靶细胞生物特性的影响。【结果】成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP。【结论】使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础。

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

小鼠免疫共刺激信号B7-1和B7-2联合表达载体的构建及包装

目的构建含小鼠B7-1和B7-2基因的双表达载体pLXSN-mB7-1-IRES-mB7-2,并包装到PA317细胞中。方法1将EcoRI和BamHI酶切下来的pMD18-mB7-2质粒上的mB7-2基因片段克隆到含有IRES片段的MINV质粒上,得到MINV-IRES-mB7-2载体;2MunI酶切载体MINV-IRES-mB7-2,末端钝化,然后BamHI再酶切,得到含钝末端和BamHI粘末端的IRES-mB7-2基因片段;3XhoI酶切质粒pLXSN-mB7-1,末端钝化,然后BamHI再酶切,形成含钝末端和BamHI粘末端的开环pLXSN-mB7-1质粒,将IRES-mB7-2基因片段插入其中,得到pLXSN-mB7-1-IRES-mB7-2双表达载体;并PA317细胞包装,PCR和电镜鉴定。结果经酶切、PCR、测序等鉴定载体构建成功,并包装到PA317细胞内。结论成功得到了双表达载体pLXSN-mB7-1-IRES-mB7-2和包装后的PA317/mB7-1-mB7-2细胞。

猪传染性胃肠炎病毒sM基因反义逆转录病毒的包装和鉴定

将编码猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)sM基因的cDNA反向插入逆转录病毒表达载体pLXSN中,质脂体法将重组质粒plxas-sM转染PA317细胞,经抗生素G418(500μg/mL)筛选出稳定的产毒细胞克隆.分别扩大培养细胞克隆,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的重组病毒滴度,最高达1.50×105CFU/mL.提取重组病毒的RNA进行RT-PCR分析,结果表明成功获得plxas-sM逆转录病毒.

人抑癌基因 nm23-H_1 在逆转录病毒载体上表达的研究

应用基因工程的方法，将抑癌基因ｎｍ２３－Ｈ１的ＤＮＡ片段克隆到逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ，得到重组质粒ｐＬＸＳＮ－ｎｍｈ１。用磷酸钙沉淀技术将重组质粒转染到辅助包装细胞ψＣＲＩＰ中，通过Ｇ４１８筛选，得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ杂交检测证实：ｎｍ２３－Ｈ１基因已整合到克隆细胞的染色体上，并且得到表达。获得的逆转录病毒滴度达１０５ＣＦＵ／ｍＬ。

人肺癌细胞γ-干扰素基因的转染及特性分析

目的 :建立转基因 A5 49细胞株 ,从特性上进行分析 ,探讨其作为抗肿瘤瘤苗的可能性。方法 :将 p L XSN质粒与人 IFN-γ基因体外重组 ,转染入人肺腺癌细胞株 A5 49中 ,经筛选获得稳定表达γ-干扰素的 A5 49- IFN-γ细胞株 ,对其生长特性、细胞表面 MHC分子表达变化、IFN-γ的分泌量及致瘤性等方面进行了探讨。结果 :转基因细胞株与原细胞株相比较 ,生长状态没有明显的变化 ,转基因细胞株可稳定表达并向细胞外分泌γ-干扰素 ;而且其细胞表面 MHC- 和 MHC- 分子表达明显增加 ,提示其免疫原性增强 ;裸鼠实验表明其致瘤性下降。结论 :该转基因细胞株有可能成为治疗肺癌的转基因瘤苗。

抑癌基因nm23-H1在逆转录病毒载体的表达

癌症转移是癌症病人死亡的主要原因之一。抑制肿瘤转移的基因ｎｍ２３－Ｈ１与ｎｍ２３－Ｈ２分别编码二磷酸核苷激酶（ＮＤＰＫ）的Ａ与Ｂ亚基〔１〕，ｎｍ２３－Ｈ１基因能有效地抑制肿瘤转移〔２〕。ｎｍ２３－Ｈ１的表达水平与黑色素瘤〔２，３〕、乳腺癌〔４〕、卵巢...