矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆及分析

矮牵牛PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亚家族的成员。该亚家族基因可能具有调控开花时间、抑制花器官衰老脱落和促进体胚形成等功能。本文应用YADE和hiTAIL-PCR等方法,克隆了PMADS9基因5′端翻译起始位点上游1853bp的启动子区域序列(FJ798977);RACE分析发现该基因至少有4个转录起始位点,2个位于编码区第一外显子内。启动子调控元件分析显示,PMADS9启动子富集花粉和种子发育过程中特异表达元件和与环境应答相关的元件;AGL15同源基因启动子存在非常保守的RY-repeat元件,启动子的保守性与物种的遗传距离不一致;推测PMADS9启动子翻译起始位点上游200～400bp和800～1000bp区域具重要功能。

矮牵牛pMADS4基因的克隆及序列分析(英文)

利用RT-PCR方法从矮牵牛(Petunia hybrida)中克隆了MADS盒基因pMADS4,进行了全序列测定。测序结果显示,所得到的基因与发表的序列同源率为100%。该基因长度为910bp,含有一个开放阅读框,编码253个氨基酸残基组成的蛋白,具有典型的植物MADS盒基因的结构,该蛋白序列与玉米(Zeamays)ZAG3、麻竹(Dendrocalamus latiflorus)DlMADS18和拟南芥(Arabidopsis thaliana)AGL6的同源性分别为64%、64%和61%,说明pMADS4是AGL6在矮牵牛中的同源基因,推测它们具有相似的功能,都促进开花并且调节花器官形成。进化树分析显示,AP1/AGL9亚家族分为SEP、AGL6和AP1三个分枝,且AGL6分枝又进一步分为三组,分别与裸子植物、单子叶植物和双子叶植物类群相对应,预测通过分离植物的AGL6同源基因可以准确的判断植物所属类群。通过蛋白预测说明pMADS4蛋白以同源或异源二聚体的形式存在,具有结合DNA的功能。

矮牵牛PMADS9基因的结构特征和mRNA的表达分析

PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亚家族成员,而AGL15基因被认为在开花植物中具有促进胚胎发生、延缓衰老进程的作用。使用PCR法克隆到了PMADS9基因的基因组序列EU338501,通过同家族基因比较分析发现矮牵牛PMADS9基因和番茄SIMBP11基因组织结构相似,和其他同源基因相比有着较长的第3外显子和庞大的1、2内含子等显著特征。通过Southern杂交初步判定其在基因组中可能为单拷贝。利用荧光定量分析发现PMADS9基因在花药和子房中优先表达,并在随后合子胚发育过程中持续表达,这与AtAGL15在拟南芥中的表达模式略有不同。对矮牵牛幼苗施加不同化学和物理处理后发现PMADS9基因对2,4-D和GA3处理有反应,并在多种胁迫环境下表达量增加,可能参与植物抗逆途径。

超量表达PMADS20-SRDX的矮牵牛花瓣和雌蕊出现异位表皮毛和气孔

以矮牵牛(Petunia hybrida)花序cDNA为模板,利用EST数据库信息,克隆了一个MADS-box基因编码区序列,GenBank登录为PMADS20(GU129907)。进化树分析表明,PMADS20属StMADS11亚家族SVP分支,与番茄和辣椒的JOINTLESS基因氨基酸序列相似性最高。定量PCR检测结果表明,PMADS20在矮牵牛营养器官中的表达量高,在花中的表达量低。构建了PMADS20的超量表达载体(35S︰PMADS20)和CRES-T(Chimeric Repressor Gene Silencing Technology)载体(35S︰PMADS20-SRDX)。35S︰PMADS20和35S︰PMADS20-SRDX转基因矮牵牛的花器官表型变化相似,花萼增大,花瓣和雌蕊出现营养器官特征,但35S︰PMADS20-SRDX的变化更为明显。扫描电镜观察显示,35S︰PMADS20-SRDX转基因花瓣下表皮的表皮毛增多,并有气孔分布;子房和花柱表面为表皮毛覆盖,呈现超量表达UNHAVEN的矮牵牛心皮的特征,并且有气孔分布。35S︰PMADS20转基因植株株形无明显变化,35S︰PMADS20-SRDX植株花序的节间较野生型短。

向日葵PMADS2 LIKE基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因是调控花发育进程的关键转录因子。在向日葵中大量的花发育相关基因有待于发掘和鉴定。本研究以向日葵(Helianthus annuus)为材料克隆到了一个MADS-box新成员PMADS2 LIKE。序列分析结果显示该基因具有MADS-box家族典型的MIKC保守结构域;系统发育树分析发现该基因与拟南芥PI基因亲缘关系最近;q RT-PCR组织表达模式分析该基因仅在花和果实中表达,且在6个花器官中仅在雄蕊和花瓣表达;q RT-PCR定量分析表示该基因从开花前25 d一直表达到开花期,并且在开花前5 d表达量最高。研究结果表明,PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中具有一定的生物学功能。本研究的结果和推论为进一步探究向日葵PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中的生物学功能提供前期数据基础,为理清MADS-box基因在向日葵花发育中的调控网络提供线索。

表皮葡萄球菌基因删除突变株构建方法的研究

目的 探讨高效的表皮葡萄球菌基因删除突变株构建方法。方法 分别应用2种不同的穿梭质粒pMAD和pBT2,连接目的基因表皮葡萄球菌双组分信号转导系统arlS、saeRS和lytS的上下游片段,构建重组质粒,电转入金黄色葡萄球菌RN4220后转入表皮葡萄球菌1457,利用抗性和生物标志筛选出针对特定目的基因的突变株SE1457-ΔarlS、SE1457-ΔsaeRS和SE1457-ΔlytS,比较2种方法的优、缺点。结果 利用pMAD和pBT2分别构建基因删除同源重组质粒pMAD-ΔsaeRS、pBT2-ΔarlS和pBT2-ΔlytS,并均获得相应的表皮葡萄球菌基因删除突变株。在筛选过程中,以pMAD为载体构建基因删除突变株,仅需1轮抗性/蓝白斑筛选过程即获突变株;而以pBT2为载体构建基因删除突变株筛选方法,需经过5～10轮的筛选才可获得突变株。基因删除突变株经聚合酶链反应（PCR）和测序等鉴定确认。与野生株相比,SE1457-ΔarlS突变株的生物膜形成能力降低90.96%,而SE1457-ΔsaeRS和SE1457-ΔlytS株的生物膜形成能力略有增加。结论 以pMAD载体构建表皮葡萄球菌突变株比较快速和简便。