重组胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的构建与表达

目的构建表达重组胸腺素α1(Tα1)的pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL-C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白(MBP-Tα1),采用Westernblot对MBP-Tα1进行鉴定。结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP-Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6%,分子量约为45×103。结论工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础。

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌不同部位的表达

目的:分析比较HBV PreS2蛋白在大肠杆菌细胞周质和细胞质中的融合表达情况。方法:构建大肠杆菌细胞周质中融合表达HBV PreS2蛋白的载体pMAL-P2x/S2和细胞质中融合表达载体pMAL-C2x/S2,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western Blot检测,分析HBV PreS2-MBP融合蛋白在菌体不同部位的表达情况及表达产物的存在形式。结果:细胞周质中表达的融合蛋白有一部分被降解了,而细胞质中表达出了完整的融合蛋白。细胞质中表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。结论:HBV PreS2-MBP融合蛋白适合在大肠杆菌细胞质中表达。

不同条件下乙肝前S2融合蛋白的表达效果分析

目的筛选含有乙肝前S2蛋白全长基因的融合表达载体pMAL-C2/S2在大肠埃希菌中的最佳表达条件。方法依次在不同的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂种类及浓度中诱导pMAL-C2/S2融合表达载体,目的产物经SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件分析,以获得最佳表达条件。结果表达载体的最适宿主菌为BL21菌株,最佳培养基为GS,最佳温度28℃;使用IPTG诱导的最佳浓度为0.5 mmol/L,使用乳糖诱导最佳浓度为1.5 mmol/L;最佳诱导时间是4 h。表达载体在最佳条件下表达时,目的蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的43.5%。结论筛选出了pMAL-C2/S2在大肠埃希菌中表达乙肝前S2-麦芽糖结合蛋白HBV PreS2-MBP融合蛋白的最佳条件。

绿色荧光蛋白原核表达载体的构建

为开发以绿色荧光蛋白(GFP)为基因的原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,通过PCR扩增获得GFP编码基因,经限制性核酸内切酶消化后将GFP定向克隆至原核表达载体pMAL-c2X中malE基因下游的EcoRⅠ与HindⅢ位点之间,与malE基因融合为一个表达框。重组产物转化E.coli TB1感受态细胞,在添加有50 mg/mLAMP、10μmol/L IPTG的LB平板上于37℃培养12～16 h后放置于25～30℃的培养箱中继续培养4～6 h,365 nmUV照射下挑取转化克隆,经扩大培养后用IPTG诱导GFP的表达并用SDS-PAGE检测表达效率。结果表明,融合在麦芽糖结合蛋白下游的GFP编码基因可以在宿主细胞中有效表达,在365 nm UV照射下,可以直接从加有50 mg/mLAMP、10μmol/L IPTG的LB平板上挑取发绿色荧光的重组克隆,SDS-PAGE分析结果显示其扩大培养物经IPTG诱导后可高效表达GFP。该结果为进一步构建以GFP为标记基因取代抗生素筛选标记的原核表达载体提供了切实的试验依据。

表达人 HGF/MBP 融合蛋白的 pMAL-MBP/HGF 重组质粒的构建及鉴定

将人ＨＧＦ完整编码区ｃＤＮＡ片段插入ＭＢＰ表达型ｐＭＡＬ－Ｃ２载体质粒中，构建了表达人ＨＧＦ／ＭＢＰ融合蛋白的ｐＭＡＬ－ＭＢＰ／ＨＧＦ重组质粒。表达的ＨＧＦ／ＭＢＰ融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析分子量约为１１０ｋＤ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ表明能被兔抗ＭＢＰ抗体和抗人ＨＧＦＭｃＡｂ所识别。结果提示可利用该表达型重组质粒制备重组人ＨＧＦ。

N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性

将菌株SS-ori的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(DCase)插入到pMAL-c2X载体中,构建表达产物为麦芽糖结合蛋白(MBP)与DCase融合的重组子。该重组子在E.coliBL21中的表达产物为融合蛋白MBP-DCase(76.4ka),光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的19%。经Amy-lose亲和纯化和Superose12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X的背景,用FactorXa剪切后,可得约41.7ka的MBP和34.7ka的DCase。酶活性检测表明当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸做为底物,A600=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸0.78g。

原钙粘蛋白γC_3(Protocadherin gamma C_3)胞内片断的克隆和表达

以原钙粘蛋白γC3的胞内序列(670 bp)为目的基因,以pMAL-c2x为载体,经过一系列的分子生物学操作,把目的基因连接到载体中并成功高效表达。

人白细胞介素16的基因克隆及其表达载体的构建

目的 通过从人外周血单个核细胞 (PBMC)中克隆编码人IL - 16的cDNA基因 ,构建人IL -16的原核高效表达系统。方法 从组胺刺激的正常人外周血单个核细胞中分离总RNA ,利用半巢式RT -PCR、T -A克隆等技术得到特异的cDNA片段 ;将含有IL - 16cDNA的质粒IL - 16 -PUC18和原核表达载体PMAL -C2 经酶切、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作 ,获得重组质粒PMAL-C2 -IL - 16 ,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达工程菌 ,Westernblotting检测表达产物。结果 经序列测定证实 ,所得片段为IL - 16cDNA ;Westernblotting检测重组体中确有抗IL - 16抗体的融合蛋白表达。结论 成功克隆了中国人IL - 16cDNA ,并表达了IL - 16融合蛋白。

GnRH-6与麦芽糖结合蛋白的融合表达及鉴定

将人工合成的哺乳动物型GnRH六聚体基因插入原核表达质粒pMAL-c2中,重组质粒转化到大肠埃希菌BL21中,采用IPTG进行诱导表达,用多糖树脂亲和层析法纯化蛋白,用SDS-PAGE对纯化蛋白进行分析,用间接ELISA方法鉴定融合蛋白的反应原性。结果表明,与麦芽糖结合蛋白基因融合的Gn-RH六聚体基因在大肠埃希菌BL21中能够高效表达;用多糖树脂进行亲和层析纯化蛋白,具有良好的纯化效果;表达的融合蛋白分子质量大小与理论值一致,且融合蛋白与GnRH抗体的反应较好。

黑色素瘤相关抗原-E1在胶质瘤中的表达和意义

一、材料与方法 提取总RNA（胶质瘤47例，相对正常脑组织14例），合成cDNA。RT-PCR扩增目的基因MAGE-E1和管家基因HPRT1的片断，分别插入载体pMAL-C2和pMD19-T并进行鉴定，稀释为不同浓度（10^9-10^3Copies／μl）的标准品；优化反应体系进行定量PCR反应，测定MAGE-E1和HPRT1的起始浓度（Copies／μ1），以MAGE-E1相对于HPRT1的量（MAGE-E1／HPRT1）表示样本中MAGE-E1 mRNA的表达量。SPSS13．0统计学分析软件处理数据。