重组胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的构建与表达

目的构建表达重组胸腺素α1(Tα1)的pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL-C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白(MBP-Tα1),采用Westernblot对MBP-Tα1进行鉴定。结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP-Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6%,分子量约为45×103。结论工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础。

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌不同部位的表达

目的:分析比较HBV PreS2蛋白在大肠杆菌细胞周质和细胞质中的融合表达情况。方法:构建大肠杆菌细胞周质中融合表达HBV PreS2蛋白的载体pMAL-P2x/S2和细胞质中融合表达载体pMAL-C2x/S2,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western Blot检测,分析HBV PreS2-MBP融合蛋白在菌体不同部位的表达情况及表达产物的存在形式。结果:细胞周质中表达的融合蛋白有一部分被降解了,而细胞质中表达出了完整的融合蛋白。细胞质中表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。结论:HBV PreS2-MBP融合蛋白适合在大肠杆菌细胞质中表达。

绿色荧光蛋白原核表达载体的构建

为开发以绿色荧光蛋白(GFP)为基因的原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,通过PCR扩增获得GFP编码基因,经限制性核酸内切酶消化后将GFP定向克隆至原核表达载体pMAL-c2X中malE基因下游的EcoRⅠ与HindⅢ位点之间,与malE基因融合为一个表达框。重组产物转化E.coli TB1感受态细胞,在添加有50 mg/mLAMP、10μmol/L IPTG的LB平板上于37℃培养12～16 h后放置于25～30℃的培养箱中继续培养4～6 h,365 nmUV照射下挑取转化克隆,经扩大培养后用IPTG诱导GFP的表达并用SDS-PAGE检测表达效率。结果表明,融合在麦芽糖结合蛋白下游的GFP编码基因可以在宿主细胞中有效表达,在365 nm UV照射下,可以直接从加有50 mg/mLAMP、10μmol/L IPTG的LB平板上挑取发绿色荧光的重组克隆,SDS-PAGE分析结果显示其扩大培养物经IPTG诱导后可高效表达GFP。该结果为进一步构建以GFP为标记基因取代抗生素筛选标记的原核表达载体提供了切实的试验依据。

N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性

将菌株SS-ori的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(DCase)插入到pMAL-c2X载体中,构建表达产物为麦芽糖结合蛋白(MBP)与DCase融合的重组子。该重组子在E.coliBL21中的表达产物为融合蛋白MBP-DCase(76.4ka),光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的19%。经Amy-lose亲和纯化和Superose12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X的背景,用FactorXa剪切后,可得约41.7ka的MBP和34.7ka的DCase。酶活性检测表明当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸做为底物,A600=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸0.78g。

原钙粘蛋白γC_3(Protocadherin gamma C_3)胞内片断的克隆和表达

以原钙粘蛋白γC3的胞内序列(670 bp)为目的基因,以pMAL-c2x为载体,经过一系列的分子生物学操作,把目的基因连接到载体中并成功高效表达。

GnRH-6与麦芽糖结合蛋白的融合表达及鉴定

将人工合成的哺乳动物型GnRH六聚体基因插入原核表达质粒pMAL-c2中,重组质粒转化到大肠埃希菌BL21中,采用IPTG进行诱导表达,用多糖树脂亲和层析法纯化蛋白,用SDS-PAGE对纯化蛋白进行分析,用间接ELISA方法鉴定融合蛋白的反应原性。结果表明,与麦芽糖结合蛋白基因融合的Gn-RH六聚体基因在大肠埃希菌BL21中能够高效表达;用多糖树脂进行亲和层析纯化蛋白,具有良好的纯化效果;表达的融合蛋白分子质量大小与理论值一致,且融合蛋白与GnRH抗体的反应较好。