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pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的研究
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作者 吴景华 王海欣 《中国妇幼保健》 CAS 北大核心 2010年第28期4119-4120,共2页
目的:利用RT-PCR法从A组轮状病毒扩增基因片段VP7,再将产物重组于大肠杆菌pMD18-T载体,探讨pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的应用。方法:提取A组轮状病毒总RNA,通过RT-PCR扩增,获得目的基因片段VP7,进行分离纯化和回收,最后把... 目的:利用RT-PCR法从A组轮状病毒扩增基因片段VP7,再将产物重组于大肠杆菌pMD18-T载体,探讨pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的应用。方法:提取A组轮状病毒总RNA,通过RT-PCR扩增,获得目的基因片段VP7,进行分离纯化和回收,最后把纯化的VP7基因与pMD18-T载体进行连接,进行质粒抽提与鉴定。结果:成功将VP7基因连接到pMD18-T载体,转化感受态菌(DH5α),通过蓝白斑筛选得到DNA阳性重组子(载体+VP7基因片段),经DNA测序鉴定正确。结论:成构建功A组轮状病毒外壳蛋白VP7基因克隆载体,为进一步获得大量VP7基因以及研究和开发轮状病毒基因工程疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 A组轮状病毒 VP7 RT-PCR pmd18-t载体
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伪狂犬病毒粤A毒株TK基因的扩增、克隆与序列测定 被引量:3
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作者 吴德铭 罗满林 +2 位作者 黄毓茂 刘镇明 邬苏晓 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期71-73,共3页
以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株 (PRVYA)的基因组为模板 ,利用聚合酶链反应 (PCR)扩增TK基因 ,获得预定大小的片段 ,将这一片段克隆到PMD18-T载体中 .对重组质粒PMD18-TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和... 以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株 (PRVYA)的基因组为模板 ,利用聚合酶链反应 (PCR)扩增TK基因 ,获得预定大小的片段 ,将这一片段克隆到PMD18-T载体中 .对重组质粒PMD18-TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较 ,证实了克隆片段的可靠性 . 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 粤A毒株 TK基因 扩增 克隆 序列测定 聚合酶链反应 pmd18-t载体
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翅碱蓬CMO cDNA基因克隆、测序及重组植物表达载体的构建 被引量:8
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作者 仲崇斌 刘长江 +2 位作者 费腾 袁晓东 孙丽慧 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期80-83,共4页
从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RT- PCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMO cDNA T-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进... 从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RT- PCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMO cDNA T-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进行酶切及克隆测序鉴定。 展开更多
关键词 胆碱单加氧酶 pmd18-t-simple载体 pBI121植物表达载体 大肠杆菌 JM109
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利用PCR技术快速制备DNA分子量标准物 被引量:10
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作者 刘慧娟 冯志国 何光源 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第2期38-39,共2页
目的:制备一套DNA分子量标准物。方法:利用多聚酶链式反应技术(PCR),以连接有9个不同大小DNA片段的pMD18-T载体为模板,M13引物为通用引物,进行大规模扩增,并进行2%琼脂糖凝胶电泳分析和利用TanonGIS凝胶图像处理系统对凝胶扫描及拍照。... 目的:制备一套DNA分子量标准物。方法:利用多聚酶链式反应技术(PCR),以连接有9个不同大小DNA片段的pMD18-T载体为模板,M13引物为通用引物,进行大规模扩增,并进行2%琼脂糖凝胶电泳分析和利用TanonGIS凝胶图像处理系统对凝胶扫描及拍照。结果:DNA分子量条带大小依次为1653bp、1173bp、691bp、606bp、496bp、401bp、326bp、238bp、155bp,条带分布适度、亮度清晰。结论:制备了能满足研究和实验室的要求DNA分子量标准物,和市售的相比,成本大大降低。 展开更多
关键词 多聚酶链式反应 pmd18-t载体 DNA分子量标准物
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抗ICAM-1单链抗体基因的克隆及序列分析 被引量:1
5
作者 李月红 张国力 +4 位作者 岳玉环 邱叶峰 李树民 吴广谋 朱平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期556-558,共3页
应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 ICAM- 1单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 F12中 ,扩增出抗体VH和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆到 p MD18- T载体中。经核苷酸序列分析... 应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 ICAM- 1单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 F12中 ,扩增出抗体VH和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆到 p MD18- T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 74 4 bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排鼠抗体可变区基因特征。 VH和 VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 (B)和轻链к 展开更多
关键词 抗ICAM-1单链抗体基因 基因克隆 序列分析 pmd18-t载体
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人α_1微球蛋白/bikunin前体cDNA的克隆与鉴定 被引量:1
6
作者 王建秋 闫风琴 +2 位作者 张赢予 李友筑 颜炜群 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期638-641,F0002,共5页
目的:从人胚胎肝、肾和胰腺组织RNA中钓取α1微球蛋白/bikunin前体(AMBP)cDNA序列,构建其重组克隆载体。方法:采用Trizol法提取人胚胎肝、肾和胰腺组织RNA,以此为模板,应用RT-PCR技术扩增目的基因,构建重组载体pMD18-T-ambp。采用蓝白筛... 目的:从人胚胎肝、肾和胰腺组织RNA中钓取α1微球蛋白/bikunin前体(AMBP)cDNA序列,构建其重组克隆载体。方法:采用Trizol法提取人胚胎肝、肾和胰腺组织RNA,以此为模板,应用RT-PCR技术扩增目的基因,构建重组载体pMD18-T-ambp。采用蓝白筛选,经限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。结果:RT-PCR显示,仅从肝组织RNA中扩增出ambp基因片段,而肾和胰腺组织中均未检测出其 mRNA的转录。构建的重组载体经SalⅠ/EcoRⅠ双酶消化得到1098bp大小的片段,与人AMBP cDNA片段大小一致。序列分析结果显示,克隆到载体中的目的基因与GenBank上登录的人AMBP cDNA序列完全一致。结论:从人胚胎肝组织RNA中成功钓取了AMBP cDNA序列,并正确构建其克隆载体pMD18-T-ambp。 展开更多
关键词 AMBP CDNA pmd18-t-ambp 克隆载体 逆转录聚合酶链反应
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人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建
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作者 刘秋英 陈伟 +4 位作者 毛国梁 熊盛 钱垂文 利奕成 王一飞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期90-92,共3页
以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒。酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子。重... 以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒。酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子。重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100%相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带。 展开更多
关键词 骨形成蛋白4 基因克隆 原核表达 pmd18-t载体 pET-22b载体
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利用接头插入技术构建环型T载体(pYCQ1) 被引量:1
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作者 杨成泉 马春泉 +2 位作者 杨达梅 蒋丹 李海英 《黑龙江大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2010年第1期117-120,共4页
人工设计接头序列,其特点为含有3′突出A末端,同时人工接头序列内部含有XcmⅠ、BspM901、AceⅡ酶切位点。利用人工接头3′突出A与线性的pMD18-T载体的3′突出T连接,将线性的pMD18-T载体改造成环形具有自身复制功能的pYCQ1载体,降低了实... 人工设计接头序列,其特点为含有3′突出A末端,同时人工接头序列内部含有XcmⅠ、BspM901、AceⅡ酶切位点。利用人工接头3′突出A与线性的pMD18-T载体的3′突出T连接,将线性的pMD18-T载体改造成环形具有自身复制功能的pYCQ1载体,降低了实验室使用T载体的成本,同时增加了载体的克隆位点。利用pYCQ1作为T载体时,用XcmⅠ酶切(XcmⅠ限制性片段具有3′T末端)pYCQ1载体可以得到线性的3′T粘性末端的pYCQ1-T载体。实验验证,pYCQ1-T载体可以在受体菌E.coliDH5α中进行大量自我复制,并能够克隆1 800 bp的外源PCR产物。 展开更多
关键词 接头 XcmⅠ pmd18-t载体 pYCQ1载体 pYCQ1-t载体
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伪狂犬病毒粤A株gE基因真核表达质粒的构建 被引量:2
9
作者 吴德铭 黄毓茂 +2 位作者 罗满林 刘镇明 邬苏晓 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期69-72,共4页
根据伪狂犬病毒(PRV)NIA 3和Rice株的gE基因序列,设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的引物,以PRV粤A毒株(PRV YA)基因组为模板,利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段,将这一片段克隆至PMD18 T载体中,获得重组质粒PMD... 根据伪狂犬病毒(PRV)NIA 3和Rice株的gE基因序列,设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的引物,以PRV粤A毒株(PRV YA)基因组为模板,利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段,将这一片段克隆至PMD18 T载体中,获得重组质粒PMD18 gE;用HindⅢ和BamHⅠ酶切该重组质粒,回收得到含有以上2个酶切位点粘端的gE基因,将此基因片段克隆至相同酶切、回收后的pcDNA3 1(+)真核表达载体中,获得真核表达重组质粒pcDNA3 1 gE,经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较,证实了克隆片段的可靠性. 展开更多
关键词 伪狂犬病毒粤A株 GE基因 真核表达 质粒构建 BarnHI酶切位点 序列测定
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基于Eam1105Ⅰ酶切的p18K-T载体的构建
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作者 周天顺 余东 +6 位作者 董皓 孙志忠 孙学武 谭炎宁 盛夏冰 段美娟 袁定阳 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期3579-3584,共6页
TA克隆是PCR产物克隆最简单的方法,而T载体的改良对提高TA克隆效率、简化克隆片段后续的酶切、连接等实验步骤有着十分重要的意义。本研究以pMD18-T载体为基础,将原有的氨苄青霉素抗性筛选标记基因替换成卡那霉素抗性筛选标记基因,克服... TA克隆是PCR产物克隆最简单的方法,而T载体的改良对提高TA克隆效率、简化克隆片段后续的酶切、连接等实验步骤有着十分重要的意义。本研究以pMD18-T载体为基础,将原有的氨苄青霉素抗性筛选标记基因替换成卡那霉素抗性筛选标记基因,克服了原载体筛选抗性(氨苄青霉素)容易失活的问题,并在原有酶切位点的基础上增加了NsiⅠ、BsaⅠ、BglⅡ、NheⅠ和AclⅠ五个酶切位点,方便了克隆片段后续的酶切和连接操作,同时在XbaⅠ和BglⅡ之间引入了两个Eam1105I限制性核酸内切酶位点,构建成一个环状中间载体p18KT-M。利用Eam1105I酶切中间载体p18KT-M可以制备3’端带有T尾的线性化p18K-T载体。经TA克隆验证,p18K-T载体连接PCR产物的效率与原pMD18-T载体的效率相当。 展开更多
关键词 TA克隆 pmd18-t载体 p18K-t载体 Eam1105Ⅰ限制性核酸内切酶
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Construction of the Plasmid Reference Molecule for Detection of Transgenic Soybean MON89788 被引量:4
11
作者 李飞武 邵改革 +7 位作者 邢珍娟 李葱葱 夏蔚 张明 Fei-wu Gai-ge Zhen-juan Cong-cong 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2010年第5期55-58,86,共5页
[Objective] The aim was to construct a plasmid reference molecule (PRM) for detection of transgenic soybean MON89788. [Method] the lectin gene sequence,3'-junction and 5'-junction sequence between host plant D... [Objective] The aim was to construct a plasmid reference molecule (PRM) for detection of transgenic soybean MON89788. [Method] the lectin gene sequence,3'-junction and 5'-junction sequence between host plant DNA integrated DNA of MON89788 soybean were amplified independently,and the three fragments were cloned into the cloning vector pMD18-T in order through molecular manipulation method to construct pMD-LM3M5,the applicability of the constructed novel PRM was tested. [Result] Sequencing confirmation result showed that the PRM was 3 700 bp in length,containing 1 029 bp of recombined DNA fragment. The limits of qualitative detection of the PRM were 10 copies. [Conclusion] The PRM constructed in this study was suitable for the identification of MON89788 event. 展开更多
关键词 Genetically modified organisms Plasmid reference molecule MON89788 soybean Event-specific detection
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大鼠NRF-1基因的克隆、鉴定及功能分析
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作者 王程铖 宋熔 +3 位作者 李君良 王玉姣 王强 赵巍 《宁夏医科大学学报》 2014年第7期731-735,F0003,共6页
目的克隆大鼠NRF-1基因并重组于载体pMD18-T,了解NRF-1基本结构和蛋白分子特征,预测可能的相关作用蛋白分子,为下一步研究NRF-1对心衰细胞能量代谢途径的作用机制提供实验材料和依据。方法通过重叠延伸PCR(SOE PCR)的方法合成目的基因序... 目的克隆大鼠NRF-1基因并重组于载体pMD18-T,了解NRF-1基本结构和蛋白分子特征,预测可能的相关作用蛋白分子,为下一步研究NRF-1对心衰细胞能量代谢途径的作用机制提供实验材料和依据。方法通过重叠延伸PCR(SOE PCR)的方法合成目的基因序列,连接于载体pMD18-T,然后转化至感受态大肠杆菌DH5α。PCR及测序鉴定重组质粒NRF-1/pMD18-T序列正确性。并通过生物信息学软件分析NRF-1的氨基酸序列,蛋白质二级结构,修饰位点及蛋白质之间作用关系等,进行预测。结果大肠杆菌DH5α中保存的重组质粒NRF-1/pMD18-T经测序鉴定,其中的NRF-1基因序列与原始序列一致。生物信息学分析表明NRF-1的蛋白质分子量为57.28kD,分子式为C2498H3976N704O808S15,等电点为5.28,是稳定的亲水蛋白,α-螺旋和β-折叠结构较多,NRF-1与mtTFA,Akt1和Spastin等多个蛋白关系密切。结论本研究成功地克隆了NRF-1基因并重组于载体pMD18-T,为后续研究NRF-1对心衰心肌细胞能量代谢的调控机制提供了实验材料和研究思路。 展开更多
关键词 NRF-1 pmd18-t 克隆
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牛γ-干扰素基因在大肠杆菌中的克隆 被引量:4
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作者 潘志明 孙辉 王运吉 《大连轻工业学院学报》 2005年第2期106-109,共4页
根据牛γ干扰素(bovIFN γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术,从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段,将RT PCR产物克隆到pMD18 T载体中,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovI... 根据牛γ干扰素(bovIFN γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术,从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段,将RT PCR产物克隆到pMD18 T载体中,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovIFN γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX 4T 1中,将pGEX 4T 1/bovIFN γ转化到大肠杆菌中DH5α中。 展开更多
关键词 大肠杆菌 Γ-干扰素基因 克隆 IFN-γ 聚合酶链式反应 限制性酶切分析 脾脏淋巴细胞 PCR产物 序列设计 cDNA 总RNA 基因序列 表达载体 基因片段 逆转录 一步法 特异性 T载体 引物 测序
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