结核分枝杆菌Rv1048c基因异源表达菌株的构建及其对小鼠巨噬细胞存活率的影响研究

目的对结核分枝杆菌H37Rv菌株中功能未知基因Rv1048c进行生物信息学分析,构建重组表达菌株MS_Rv1048c,并研究其对小鼠巨噬细胞存活率的影响。方法软件在线分析Rv1048c的氨基酸序列及其编码蛋白的基本性质,利用PCR扩增Rv1048c目的片段,构建重组质粒pMV261-Rv1048c,转入耻垢分枝杆菌,构建重组菌株MS_Rv1048c与空载菌MS_vec。分析该基因对菌株生长的影响;通过CCK-8、总胆固醇测定和油红(O)染色的方法,初步探究重组菌株感染巨噬细胞后对其活性的影响。结果Rv1048c基因全长1116 bp,蛋白由371个氨基酸构成,分子式是C_(1778)H_(2821)N_(521)O_(525)S_(10),预测该蛋白是一种定位在细胞外的含有多个磷酸化位点的、不稳定的亲水性蛋白。本试验首次成功构建未知基因Rv1048c的异源表达载体,生长曲线测定发现该基因使菌株生长缓慢,细胞实验发现基因增强了重组菌株对细胞的侵袭能力。结论Rv1048c可能具有结核分枝杆菌独有的生长特性,并降低在菌株侵染下的细胞的存活率。分析Rv1048c未知基因和构建异源表达菌株,有助于后续对结核分枝杆菌Rv1048c基因功能的探究,为进一步解析结核分枝杆菌的致病机制奠定了基础。

结核分枝杆菌Rv2629基因产物的亚细胞定位和穿梭质粒转化耻垢分枝杆菌

目的研究结核分枝杆菌利福平耐药相关蛋白Rv2629在细胞内的亚定位及其与药敏的相关性。方法采用差速离心进行细胞组分分离及蛋白质印迹法(Western blot)检测初步判定蛋白亚细胞定位;采用pMV261转化耻垢分枝杆菌,BACTEC MGIT960测定转化菌株的利福平耐受性。结果Rv2629蛋白主要定位于结核分枝杆菌的细胞壁和细胞膜,重组有Rv2629突变位点191C质粒的耻垢分枝杆菌对利福平的最低抑菌浓度(MIC)为160mg/L,相应的携带有野生型基因191A的宿主菌MIC为20mg/L。结论Rv2629基因191A/C突变同利福平耐药相关。

结核分枝杆菌rv0199基因在耻垢分枝杆菌中的表达及检测

为研究结核分枝杆菌(M.tb)rv0199基因在该病原致病性中可能发挥的作用,本研究克隆了rv0199基因,在耻垢分枝杆菌(Ms)中异源表达,并对其表达进行检测。将大肠杆菌—分枝杆菌穿梭表达载体pMV261进行改造,向载体中引入常用的6His和StrepⅡ重组蛋白标签,命名为pMV262。使用Ms/pMV262表达系统对rv0199基因进行超表达,用抗6His标签抗体和抗StrepⅡ标签抗体均能特异的检测到重组蛋白。本试验改造的pMV262穿梭表达载体可很方便的检测M.tb的基因在Ms中的异源表达,不用制备针对蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。构建的重组菌Ms/262-99为进一步研究rv0199基因的功能提供了材料,奠定了基础。

牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

试验旨在构建牛分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物学活性。采用PCR技术扩增并克隆牛分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261-Mbeis,经双酶切和测序鉴定其正确性,利用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155中,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达,质谱鉴定目的蛋白氨基酸序列。研究结果表明,成功构建了牛分枝杆菌eis基因穿梭表达载体pMV261-Mbeis;生长曲线表明负载重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE和Western blotting检测证实了牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中可表达出分子质量约44ku的eis蛋白;质谱检测证明了该蛋白即为牛分枝杆菌eis蛋白。本研究构建的牛分枝杆菌eis基因穿梭表达质粒pMV261-Mbeis在耻垢分枝杆菌中具有生物学活性,为下一步研究表达产物eis蛋白的功能奠定了基础。

结核杆菌eis基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的:构建结核分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物活性。方法:采用PCR技术克隆结核分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMVe-is,经酶切和测序鉴定其正确性,用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155中,采用SDS-PAGE和Western blot检测eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达。结果:成功构建结核杆菌eis基因穿梭表达载体pMV-eis;生长曲线说明重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE和Western blot检测证实eis在耻垢分枝杆菌中可表达出相对分子量约42kDa的Eis蛋白。结论:成功构建了eis基因穿梭表达质粒pMV-eis,且该重组质粒在耻垢分枝杆菌中具有生物活性,为下一步研究表达产物Eis的功能奠定了一定基础。