沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定

目的构建沙眼衣原体(CT)pORF5蛋白基因重组质粒pGEX-6p/pORF5,表达并纯化质粒蛋白pORF5,并鉴定其免疫原性。方法用PCR法扩增pORF5基因,定向插入pGEX-6p原核表达载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达pORF5融合蛋白,融合蛋白纯化后免疫BALB/c鼠,ELISA及Western-blot分析pORF5质粒蛋白免疫原性及免疫反应性。结果PCR扩增出795 bp基因片段,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的D型Ct一致;pORF5融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1∶25 600。结论pORF5蛋白在原核细胞中可有效表达并具有较好的免疫原性,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件。

沙眼衣原体pORF5蛋白真核表达系统的构建与鉴定

目的构建沙眼衣原体(Ct)pORF5基因重组质粒pDSRed-C1/pORF5,建立pORF5稳定转染的表达系统并对其进行鉴定。方法PCR法扩增pORF5基因,定向插入pDSRed-C1真核表达载体构建pDSRed-C1/pORF5重组体,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,用脂质体介导的基因转染法,分别将pDSRed-C1/pORF5和pDSRed-C1导入HeLa-229细胞,通过G418筛选获得转入目的基因的阳性细胞克隆;荧光显微镜和Western blot检测pORF5蛋白在细胞中的表达。结果所克隆的pORF5基因片段经测序完全正确;转染pDSRed-C1/pORF5的HeLa-229细胞大部分有pORF5蛋白的表达,而转染空载体pDSRed-C1或未转染的HeLa-229细胞,均未见pORF5蛋白表达。结论成功构建了稳定表达外源新基因pORF5的细胞系,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件。

沙眼衣原体pORF5稳定转染HeLa细胞后宿主蛋白转录谱分析

目的分析沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）质粒蛋白pORF5基因对HeLa细胞蛋白质表达谱的影响，为深入研究Ct致病机制提供实验依据。方法构建pORF5基因慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293T细胞包装慢病毒颗粒，收集慢病毒后感染HeLa细胞，流式细胞术多次分选获得pORF5基因稳定转染的HeLa细胞系（pORF5-HeLa细胞系）和对照HeLa细胞系。采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术结合二维液相色谱串联质谱（2DLC-MS/MS）技术建立pORF5-HeLa细胞和对照HeLa细胞蛋白质表达谱，筛选并构建差异蛋白质表达数据库，采用qRT-PCR和Western blot方法对部分差异蛋白质进行验证。结果成功建立了稳定过表达pORF5基因的HeLa细胞系和对照细胞系；采用iTRAQ结合2D LC-MS/MS质谱技术共鉴定了314个差异表达的宿主蛋白质，其中有159个蛋白质表达上调，155个蛋白质表达下调。差异蛋白质主要涉及代谢过程、免疫应答、生物黏附等众多事件。pORF5基因转染的HeLa细胞中组蛋白H1.2C（HIST1H1C）、血红蛋白α亚基（HBA1）、帕金森蛋白（PARK7）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、HMGB2的mRNA表达水平上调，而胞内氯离通道蛋白1（CLIC1）、细胞角蛋白7（KRT7）、SFN（14-3-3σ）、周期素依赖性刺激抑制因子2A（CDKN2A）的mRNA表达水平下调，Western blot证实PARK7、HMGB1蛋白表达水平增加，这些结果均与蛋白质组学结果一致。结论成功构建了pORF5基因稳定转染HeLa细胞的差异蛋白质表达谱，发现了一组受pORF5基因调控并与细胞代谢、增殖和黏附等生物学过程相关的差异表达蛋白质。提示pORF5可能通过改变宿主蛋白质的表达，影响宿主细胞生物学行为以促进Ct的生长发育。