衣原体pORF5质粒编码蛋白致病机制的研究进展

衣原体(Chlamydia)是一类具有独特的两相发育周期、专性细胞内寄生的革兰阴性菌,能引起人类多种疾病。pORF5是衣原体隐蔽性质粒编码的分泌性效应蛋白。近年来研究证实,pORF5质粒编码蛋白是衣原体重要的毒力蛋白,与衣原体致病密切相关。现就衣原体pORF5质粒编码蛋白的生物学特性、致炎性作用、抗凋亡作用及促自噬作用作一概述。

质粒蛋白pORF5在沙眼衣原体感染细胞中的定位及免疫原性研究(英文)

目的分析沙眼衣原体隐蔽性质粒编码的质粒蛋白pORF5在感染细胞中的定位并初步探讨免疫原性特征。方法 PCR扩增pORF5质粒蛋白编码基因,构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体转化大肠杆菌XL1-blue中诱导表达融合蛋白;融合蛋白经Glutathione Sepharose亲和层析纯化后免疫小鼠,制备单克隆抗体和多克隆抗体,间接免疫荧光技术及免疫印迹鉴定抗体的特异性,并分析pORF5质粒蛋白在感染细胞中的分布特征。采用ELISA方法分析pORF5质粒蛋白的免疫原性。结果 pORF5原核表达重组体成功构建,融合蛋白在大肠杆菌中可溶性表达;pORF5主要分布于宿主细胞胞浆,但也少量分布在EB、RB上;pORF5能与衣原体患者血清及鼠免疫血清发生强烈地免疫反应。结论 pORF5为衣原体分泌蛋白,并具有很强的免疫原性。

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活NALP3炎性复合体诱导THP-细胞产生IL-1β和IL-18

目的:探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5质粒蛋白对IL-1β和IL-18等促炎性细胞因子的诱生作用,并初步分析其分子机制。方法:用0、3、6、12、24、36μg/ml不同浓度的pORF5蛋白刺激THP-1细胞,并于0、8、16、24、36 h收集上清及细胞,ELISA检测IL-1β和IL-18的含量;Realtime-PCR检测NALP3炎性复合体mRNA表达水平,Western blot鉴定Caspase-1活化状态;分别用NALP3 siRNA、ASC siRNA转染THP-1细胞24 h或用Caspase-1特异性抑制剂(Z-YVADFMK)预处理THP-1细胞30 min后,再用24μg/ml的pORF5质粒蛋白刺激THP-1细胞24 h,ELISA分析各处理因素对IL-1β和IL-18产生的影响。结果:pORF5质粒蛋白以浓度依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β和IL-18。当pORF5质粒蛋白浓度为24μg/ml时,IL-1β和IL-18的表达水平最高,分别为491 pg/ml、186 pg/ml;同时pORF5质粒蛋白以时间依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β和IL-18,两者分别在24 h和16 h达到峰值。pORF5质粒蛋白可增强THP-1细胞NALP3、ASC和Caspase-1 mRNA的表达,促进Caspase-1的活化;NALP3-siRNA、ASC-siRNA及Caspase-1抑制剂处理组IL-1β和IL-18的产生水平均显著低于对照组(P<0.05)。结论:pORF5质粒蛋白通过激活NALP3炎性复合体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18。

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白免疫优势片段的筛选与鉴定

目的:鉴定沙眼衣原体pORF5质粒蛋白的免疫原性,并进一步筛选和确定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。方法:以沙眼衣原体D血清型DNA为模板,设计pORF5基因全长和9个不同片段特异引物进行PCR扩增,PCR产物经Bam HⅠ、NotⅠ双酶切后插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX-6p中,构建pORF5质粒蛋白不同长度片段的原核表达重组体,重组体经PCR和测序鉴定后,转化XL1 Blue大肠杆菌表达10种不同长度的GST融合蛋白;ELISA方法检测pORF5质粒蛋白的免疫原性,Western blot鉴定pORF5质粒蛋白的免疫反应性;ELISA测定10个不同片段与沙眼衣原体生殖道感染患者血清、鼠免疫血清以及抗pORF5单克隆抗体的免疫反应性,鉴定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。结果:pORF5质粒蛋白免疫原性强,能刺激机体产生高效价抗体;破坏pORF5质粒蛋白天然空间结构,其免疫反应性基本消失;在ELISA反应中,N端缺失66氨基酸的F6片段的免疫反应强度与pORF5全长基本相似,F2与F3出现较弱的免疫反应,其余片段免疫反应消失。结论:pORF5质粒蛋白为构象依赖性免疫优势抗原,其免疫优势表位和构象表位位于C端,本研究为进一步探讨pORF5质粒蛋白的生物学功能和疫苗的研制提供实验依据。

NS5A-TP5蛋白结合蛋白1的基因克隆化研究

目的 :应用酵母双杂交技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆NS5A TP5蛋白结合蛋白基因1(NBP1)。方法 :应用酵母双杂交系统 3 ,构建NS5A TP5诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y 187进行配合 ,于涂有x α gal营养缺陷型培养基 (SD/Trp Leu His Ade)上筛选生长。 结果 :挑选蓝色克隆 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序 ,然后进行生物信息学分析 ,新基因的开放读码框架长度为 2 40个核苷酸 (nt) ,编码产物由 79个氨基酸残基 (aa)组成 ,命名为NBP1,GenBank注册号为AY 45 92 91。结论 :NBP1的筛选与克隆 ,可为进一步研究HCVNS5A

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白诱发小鼠生殖道免疫损伤初步研究

目的研究沙眼衣原体（Ch／amyd／atrachomatis，ct）pORt5质粒蛋白对小鼠生殖道组织的免疫损伤作用，并初步探讨其损伤机制。方法表达纯化GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白经PreScissionProtease酶切和去内毒素处理后分别在第1、3、6天接种于BALB／c小鼠阴道后穹窿，第7天处死小鼠，分离小鼠生殖道组织，肉眼大体观察并进行炎症病理评分；ELISA方法检测血清、阴道灌洗液和小鼠脾细胞培养上清中的TNF-a、IL-1β和IL石细胞因子水平。结果pORF5蛋白接种组小鼠输卵管壶腹部与峡部出现不同程度的肿胀，周围结缔组织发生黏连，并出现了不同程度的扭曲与积水，而PBS和csr（谷胱甘肽S-转移酶）蛋白对照组输卵管组织未出现明显改变；同时生殖道组织炎症病理积分明显高于PBS对照组（P〈0．01）和GST对照组（P〈0．01）；pOaF5蛋白接种组小鼠脾细胞培养上清、阴道分泌物中TNF-a、IL-IB、Ib6水平均显著高于PBS和GST蛋白对照组（P〈0．05）；血清中TNF-a、IL-1B水平显著高于PBS和GST蛋白对照组（P〈0．01）。结论pOaF5蛋白能引起BAIB/c小鼠生殖道组织免疫损伤，该损伤机制可能与TNF-a、IL-115、IL石等炎症因子水平升高有关。

pORF5质粒蛋白拮抗LL37抗菌肽增强沙眼衣原体感染的初步研究

目的 探讨pORF5质粒蛋白能否通过抑制LL37抗菌肽增强沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）感染,并初步探讨其分子机制.方法 表达并纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经蛋白酶酶切制备不含GST标签的pORF5蛋白;pORF5蛋白和LL37单独或共孵育衣原体后再感染HeLa细胞,间接免疫荧光技术计数衣原体包涵体形成数量;荧光定量PCR检测TNF-α、LL37基因表达水平.结果 单独Ct感染组衣原体包涵体形成单位（IFU）为3.8×105/ml,LL37处理组IFU为2.0 × 105/ml,pORF5蛋白处理组IFU为3.0×105/ml,pORF5蛋白和LL37共处理组IFU为3.1×10/ml.pORF5蛋白处理组、LL37与pORF5蛋白共处理组和单独Ct感染组之间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,但明显高于LL37单独处理组（P＜0.05）.pORF5蛋白和LL37共同处理组TNF-α表达水平明显高于LL37单独处理组（P＜ 0.01）;pORF5蛋白处理组较Ct处理组LL37基因转录水平下降了19％.结论 pORF5质粒蛋白能拮抗LL37抗菌肽增强Ct感染,其机制可能与上调肿瘤坏死因子α、下调LL37表达相关.

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对HeLa细胞自噬的影响

目的探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)质粒蛋白pORF5对HeLa细胞自噬的影响,为进一步阐明Ct致病机制提供实验依据。方法 PCR扩增Ct pORF5质粒蛋白基因,克隆入PLenO-DCE慢病毒质粒,构建慢病毒重组表达载体。慢病毒重组表达载体经双酶切及测序鉴定后与辅助质粒共转染293T细胞,制备慢病毒。收集慢病毒,再感染HeLa细胞,流式细胞仪分选获得pORF5基因稳定转染细胞株(PLenO-DCE/pORF5-HeLa)。实验同时建立对照细胞株(PLenO-DCE-HeLa)。血清饥饿处理两组细胞24h,Real-time PCR和Western blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Becin1的蛋白和mRNA表达水平,计算LC3-II/LC3I比率;采用间接免疫荧光检测自噬荧光斑点。结果 PLenO-DCE/pORF5-HeLa和PLenO-DCE-HeLa细胞饥饿处理后均出现LC3红色荧光斑点,斑点数分别为(97.6±12.1)个/细胞和(34.0±2.6)个/细胞,差异有统计学意义(t=45.36;P<0.05);饥饿处理后PLenO-DCE-HeLa和PLenO-DCE/pORF5-HeLa细胞中LC3、Beclin1的mRNA表达水平均显著高于未处理组,其中PLenO-DCE/pORF5-HeLa细胞中LC3、Beclin1mRNA的表达水平较未处理组增加3.10倍(t=95.25;P<0.01)和0.85倍(t=16.56;P<0.05),较PLenO-DCE-HeLa细胞分别增加1.95倍(t=79.12;P<0.01)和1.57倍(t=23.95;P<0.05);PLenO-DCE/pORF5-HeLa经饥饿处理24h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率和Beclin1蛋白较未处理组分别增加52.17%和76.00%(t值分别是15.13,57.24;P均<0.05),较PLenO-DCE-HeLa细胞组分别增加1.05倍(t=35.21;P<0.05)和4.34倍(t=112.23;P<0.01)。结论 pORF5质粒蛋白可诱导HeLa细胞自噬,可能在Ct致病过程中发挥重要作用。

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活p38MAPK和NALP3信号通路调控THP-1细胞IL-1β分泌的研究

目的研究沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5质粒蛋白诱导THP-1细胞产生IL-1β的分子机制,为阐明Ct致病机制提供实验依据。方法将原核表达重组体pGEX-6p/pORF5转化大肠埃希菌,表达并纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经蛋白酶酶切后制备不含GST标签的pORF5蛋白;用不同浓度的pORF5蛋白体外刺激THP-1细胞,ELISA测定不同时间IL-1β水平;分别用NALP3siRNA、ASC siRNA、Caspase-1抑制剂和p38抑制剂预处理THP-1细胞,再用pORF5蛋白刺激THP-1细胞24h,ELISA测定IL-1β含量,Real-time PCR测定IL-1β和NALP3炎性体mRNA的表达,Western blot分析Caspase-1的表达及p38磷酸化水平。结果 pORF5蛋白以剂量和时间依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β,24μg/ml pORF5蛋白刺激24h时IL-1β的表达水平达到峰值(495.1±55.5pg/ml);pORF5蛋白能促进THP-1细胞中NALP3炎性体mRNA的表达;NALP3-siRNA、ASC-siRNA及Caspase-1抑制剂预处理THP-1细胞后,IL-1β分泌量分别降低37.7%、71.3%和40.1%;p38抑制剂能降低NALP3炎性体mRNA及IL-1β分泌量(P<0.01),但抑制NALP3炎性体后p38磷酸化水平未受影响(P>0.05)。结论 pORF5质粒蛋白通过激活p38MAPK和NALP3信号通路共同调控IL-1β的产生和分泌。

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白单克隆抗体2H4的纯化及其免疫学特性研究

目的 纯化抗沙眼衣原体pORF5单克隆抗体2H4并鉴定其免疫学特性.方法 大量培养pORF5单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株并收集培养上清,采用G蛋白免疫亲和层析法纯化2H4单克隆抗体；酶联免疫吸附试验（ELISA）测定2H4效价及抗体亚类；Western blot鉴定其特异性；免疫荧光试验（IFA）检测2H4单克隆抗体的衣原体种属特异性.结果 纯化后2H4抗体的纯度高达93％；效价为1：1024,免疫球蛋白类型为IgG2a;2H4抗体不仅能特异性识别pORF5融合蛋白,而且能特异性识别Ct血清型A、D、L2、鼠农原体（MoPn）、鹦鹉热嗜农原体（6BC）质粒所编码的内源性pORF5蛋白,但不识别衣原体其他质粒蛋白和肺炎嗜衣原体（Cpn）.结论 获得了高纯度的能特异识别pORF5质粒蛋白的单克隆抗体,为进一步研究pORF5蛋白结构和功能以及沙眼衣原体诊断试剂盒的研制奠定了良好的基础.

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抑制肿瘤坏死因子α诱导HeLa细胞凋亡

目的 探讨沙眼衣原体质粒蛋白pORF5对肿瘤坏死因子α（TNF？α）诱导HeLa细胞凋亡的影响。方法 将含pORF5基因的慢病毒重组表达载体与辅助质粒共转染293T细胞制备慢病毒，慢病毒收集浓缩后再感染HeLa细胞，流式细胞仪分选获得pORF5基因稳定转染细胞株（pORF5？HeLa），同时建立空载体转染对照细胞株（对照HeLa）。将两种细胞株分别分为两组，一组用20 μg/L TNF？α处理（处理组），一组仅用新鲜培养基培养（未处理组），作用6 h，Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率，实时 PCR检测凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl？2和Bax mRNA表达水平，Western印迹检测Bax、Bcl？2蛋白表达水平。结果 TNF？α处理细胞6 h后，Hoechst33258染色发现pORF5？HeLa和对照HeLa细胞中均可见不同程度的核固缩、碎裂，高亮蓝色凋亡小体；pORF5？HeLa细胞的凋亡率为（35.5 ± 4.5）%，对照HeLa细胞凋亡率为（63.6 ± 5.8）%，均显著高于相应未处理组［（9.5 ± 1.5）%和（7.9 ± 0.9）%，t值分别为13.53、32.36，均P 〈 0.01］。处理组pORF5？HeLa细胞中Bax和Caspase3 mRNA表达水平较处理组对照HeLa细胞分别降低72.8%和84.5%（t值分别为35.29，42.25，均P 〈 0.01），但Bcl？2 mRNA的表达水平显著高于处理组对照HeLa细胞（t = 87.12，P 〈 0.01）。处理组pORF5？HeLa细胞中Bax蛋白表达水平亦显著低于处理组对照HeLa细胞（t = 17.58，P 〈 0.01），而Bcl？2蛋白表达水平较对照HeLa细胞增加6.8倍，差异有统计学意义（t = 18.93，P 〈 0.01）。结论 pORF5可能通过增强抗凋亡蛋白Bcl？2降低促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表达，抑制TNF？α诱导的HeLa细胞凋亡。

沙眼衣原体质粒蛋白pORF5生物学特性初步研究

目的 分析沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）隐蔽性质粒编码的质粒蛋白pORF5在感染细胞中的定位并初步探讨其生物学特征.方法 PCR扩增pORF5质粒蛋白编码基因,构建pORF5原核表达重组体并诱导表达融合蛋白 融合蛋白经Glutathione Sepharose亲和层析纯化后免疫小鼠,制备单克隆抗体和多克隆抗体,间接免疫荧光技术及免疫印迹鉴定抗体的特异性 分析pORF5质粒蛋白在感染细胞中的分布及表达模式特征.采用ELISA分析pORF5质粒蛋白在自然感染状态下的表达情况及免疫原性.结果 pORF5主要分布于宿主细胞质,但也少量分布在原体（EB）和网状体（RB）上,在细胞质中的分布模式与衣原体分泌蛋白酶样活性因子（CPAF）基本相似,激光共聚焦结果显示两者并不重叠 pORF5能与Ct生殖道感染患者血清发生强烈的免疫应答.结论 pORF5为衣原体分泌蛋白,并具有很强的免疫原性 在自然感染状态下,pORF5质粒蛋白基因被激活产生内源性靶蛋白.

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白经TLR2激活MAPKs信号通路诱导人单核细胞产生前炎症细胞因子

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)可引起泌尿生殖道感染,导致不孕、异位妊娠等严重并发症.过度的炎症反应被认为是Ct感染造成机体生殖道免疫病理损伤的重要原因,但其具体机制尚不清楚.本研究旨在探讨Ct质粒蛋白pORF5的潜在致炎活性,以及与TLR2和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的关系.结果表明,pORF5蛋白以剂量和时间依赖方式诱导THP-1细胞产生TNF-α,IL-1β,IL-8等前炎症细胞因子.进一步研究表明,pORF5蛋白能激活p38/MAPK和ERK/MAPK,但不能激活JNK/MAPK;p38/MAPK和ERK/MAPK特异性抑制剂及TLR2抗体能降低前炎症细胞因子产生水平.该研究初步证实,pORF5质粒蛋白经TLR2活化的p38/MAPK和ERK/MAPK通路诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子,pORF5质粒蛋白可能是Ct重要的致病因子,参与Ct炎症病理过程.

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白调控MDM2-p53通路抑制细胞凋亡的研究

目的探讨沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对细胞凋亡的影响,以及与MDM2-p53通路的关系,为阐明沙眼衣原体致病机制提供实验依据。方法用不同浓度的pORF5质粒蛋白以不同时间的刺激TNF-α预处理的HeLa细胞,采用Hoechst 33342染色及流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Western blot检测p53的表达水平以及鼠双微体2(MDM2)的磷酸化水平;采用间接免疫荧光法分析MDM2在细胞内的定位;分别经MDM2抑制剂Nutlin3a预处理Hela细胞1 h,pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞24 h,采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,分析凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平及MDM2磷酸化水平。结果 pORF5质粒蛋白能使TNF-α诱导的细胞凋亡率降低29%;p53蛋白的表达与pORF5浓度呈现出一定的时间和浓度依赖性,当pORF5浓度达10μg/mL时,p53的表达水平随pORF5浓度的升高而显著降低(P<0.05);pORF5刺激Hela细胞8 h后p53表达开始下调,并且随时间的延长,p53的蛋白表达显著减少(P<0.05);pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞15 min后,MDM2开始发生磷酸化反应,30 min达到峰值;间接免疫荧光试验检测显示pORF5质粒蛋白可促进MDM2发生核转位;MDM2抑制剂Nutlin3a能上调Bax蛋白的表达,下调Bcl-2的表达,并能促进细胞凋亡,Nutlin3a处理组细胞凋亡率较对照组增加约11%(P<0.05)。结论 pORF5质粒蛋白通过激活MDM2-p53通路促进Bcl-2蛋白的表达和降低Bax蛋白的表达抑制细胞凋亡。

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过HMGB1抑制细胞凋亡机制的初步研究

目的探讨pORF5质粒蛋白抗凋亡分子机制,为进一步阐明沙眼衣原体致病机制提供实验依据。方法将HeLa细胞分为两组,一组用凋亡诱导剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)刺激30 min,另一组经pORF5质粒蛋白预处理18 h后,再用CCCP刺激30 min。然后,Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶3(caspase-3)的表达水平;JC-1荧光探针检测HeLa细胞线粒体膜电位变化;间接免疫荧光观察细胞色素c释放情况。为了分析高迁移率族蛋白1(HMGB1)是否参与pORF5质粒蛋白的抗凋亡作用,分别用HMGB1 shRNA和对照RNA稳定转染HeLa细胞,再用pORF5质粒蛋白与CCCP共刺激两种细胞后,测定Bcl-2、Bax和活化的caspase-3蛋白的表达以及细胞色素c的释放情况。两组间比较采用配对样本t检验。结果pORF5质粒蛋白能拮抗CCCP诱导的线粒体膜电位的下降,CCCP单独处理组Hela细胞红/绿荧光强度比率为0.4 ± 0.1,显著低于pORF5与CCCP共处理组(1.7 ± 0.3,t = 6.95,P < 0.01)。与对照组相比,pORF5与CCCP共处理组HeLa细胞Bcl-2蛋白表达水平增加(5.3 ± 0.6)倍(t = 8.62,P < 0.01),而Bax和活化的caspase-3平均表达水平分别降低79%± 10%(t = 9.23,P < 0.01)和75%± 8%(t = 4.26,P < 0.05)。与对照RNA转染组相比,HMGB1 shRNA转染组HeLa细胞线粒体膜电位下降(t = 11.23,P < 0.01),细胞色素c释放增加,Bcl-2的表达水平降低(t = 7.19,P < 0.05),而Bax的表达水平增加(t = 13.06,P < 0.01)。结论沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过HMGB1阻断线粒体凋亡途径发挥抗凋亡作用。