利用透明颤菌血红蛋白基因vgb改造毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的研究

为了解决酵母发酵时贫氧限制目的蛋白表达量,利用透明颤菌血红蛋白基因vgb设计毕赤酵母分泌 型表达载体pPIC9K-vgb,并以人乳铁蛋白基因为目的基因转入毕赤酵母GS115。研究结果表明,该表达载体具 有转化操作简单、后期工程菌筛选简便、菌体耐低氧能力强、目的蛋白摇瓶表达量高等优点。该表达载体也可 以通过直接替换目的基因而用于其他蛋白表达系统的开发研究。

黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其酵母表达载体构建

以黑曲霉A9基因组为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)直接对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T载体,经DNA测序,该基因为1 743 bp,编码581个氨基酸。该基因序列已在GeneBank注册,登录号为DQ836361。用限制性内切酶切下目的基因,插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成表达载体pPIC9K-GOD。重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-GOD的构建,可望获得超量表达的高活性葡萄糖氧化酶,为研制高品质的酶制剂奠定基础。

重组水貂生长激素真核表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

【目的】构建水貂生长激素(mGH)基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得水貂生长激素奠定基础。【方法】将体外合成的水貂生长激素基因插入分泌型表达载体pPIC9K。将重组的pPIC9K-mGH用SacI酶切后,LiC1法转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,经G418筛选后进行甲醇诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blot检测酵母上清中水貂生长激素的表达。【结果】酵母上清中可见与目的蛋白相对分子量(31kd)相符的条带,该条带可被水貂生长激素多克隆抗体特异识别。【结论】正确构建了水貂生长激素真核表达载体,该蛋白能在巴斯德毕赤酵母中成功表达。

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1。PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列。并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中。因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达。

β_2-糖蛋白I及第五结构域cDNA克隆和序列分析

β2-糖蛋白I(β2-glycoprotein I:β2-GPI)是抗磷脂综合症抗磷脂抗体的主要抗原,其与自身免疫性疾病、动脉硬化以及血栓形成等疾病密切相关。在本研究中,我们从人肝组织中成功克隆出人β2-糖蛋白I及其第五结构域的基因,并构建了蛋白表达体系,为寻找β2-糖蛋白I及其功能区与自身免疫性疾病相关抗原和抗体之间、与动脉硬化与血栓形成之间的相关性,为这些疾病的临床治疗和诊断提供理论依据。

草鱼生长激素基因在毕赤酵母中的表达

将草鱼生长激素基因(cGH)的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH在毕赤巴斯德酵母GS115菌株中获得了高效表达。

人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接PTH和HSA基因,并将构建好的融合基因插入到载体pUC19测序后插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOXⅠ和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白PTH-HSA。重组质粒pPIC9K/PTH-HSA经SalI线性化后,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到的转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到表达;Westernblot分析表明发酵液上清中表达的融合蛋白PTH-HSA具有HSA的抗原性:用酶标法测定发酵上清中融合蛋白的甲状旁腺激素活性为318IU/ml。

重组人血管内皮生长因子165在Pichia酵母中的表达

目的 :采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF1 65蛋白。方法 :自人肿瘤组织中获取人VEGF1 65cDNA ,构建pPIC9K酵母表达载体 ,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果 :SDS PAGE及Western blot结果显示目的蛋白已成功表达。结论 :在Pichia酵母中成功表达人VEGF1 65。

黄粉虫纤溶活性基因的克隆及在毕赤酵母中的表达及活性检测

采用PCR技术,以含有TFP(Tenebrio Fibrinolyric Proteins,TFP)c DNA质粒作为模板,扩增出TFP基因片段.将克隆获得的目的基因插入到毕赤酵母表达载体p PIC9K中,经测序无误后,获得重组表达质粒p PIC9K-TFP.将重组表达质粒线性化后电击转化到毕赤酵母GS115中,经筛选并PCR验证获得多拷贝整合型酵母工程菌,对工程菌进行发酵和甲醇诱导表达.阳性样品经纤溶平板实验验证,表明该表达蛋白具有生物活性.

低温脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

通过PCR技术扩增得到南极适冷菌低温脂肪酶基因lip-948,将其与表达载体pPIC9K连接后转化巴斯德毕赤酵母GS115,通过筛选得到高效表达低温脂肪酶的酵母菌株,该菌株发酵48 h后上清液中脂肪酶活力达到27.5 U.mL-1,普遍高于其他细菌低温脂肪酶在毕赤酵母中的表达活性。

巨噬细胞抑制因子在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的:在毕赤酵母表达系统中获得巨噬细胞抑制因子(MIC-1)高效分泌表达,并鉴定其免疫活性。方法:从BeWo细胞系中提取总RNA,通过反转录PCR获得目的片段,然后将基因亚克隆入pPIC9k表达载体,线性化后转化GS115酵母细胞,经G418抗性筛选获多拷贝重组子并诱导表达,PCR鉴定目的基因的整合。表达产物用Westernblot鉴定生物活性。结果:经过G418筛选到34株阳性克隆,MIC-1蛋白最高表达量为6.332mg/L。结论:成功构建了MIC-1表达载体,在酵母中获得多拷贝高效表达,并且形成正确的蛋白结构。