河南华溪蟹金属硫蛋白原核表达载体的构建

[目的]构建河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)金属硫蛋白(MT)的原核表达载体。[方法]以大肠杆菌DH-5α中的pGEM-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段并连接至pGEM-T载体。然后,亚克隆至pQE31表达载体,转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞。[结果]PCR扩增目的片段产物大小约为220 bp,与预期大小一致。重组质粒pQE31-MT双酶切鉴定结果也与预期相符。[结论]成功构建了MT原核表达载体,为今后表达并纯化MT提供了材料。

重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE30中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行TricineSDSPAGE电泳分析和WesternBlot检测分析.结果构建了重组融合表达质粒pQE30Tum5,表达的蛋白经TricineSDSPAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.

重组人TGF-β1在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性测定

目的:构建人转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的原核表达载体,表达、纯化并鉴定该蛋白。方法:应用基因重组技术,构建人TGF-β1原核表达载体pQE30-TGF-β1,用SDS-PAGE电泳分析所表达蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白后用Western blot检测,同时用该蛋白免疫BALB/c小鼠,测定免疫血清效价。结果:成功构建了人TGF-β1的原核表达载体pQE30-TGF-β1,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在约Mr14kDa处出现了一条新生的蛋白条带。经Ni-NTA亲和层析纯化后,Western blot检测显示,重组蛋白6×his-TGF-β1能很好地与抗TGF-β1单克隆抗体特异性结合,并能够诱导BALB/c小鼠产生抗人TGF-β1的中和抗体,免疫血清的效价为1:10000。结论:转化生长因子β1是一种多功能细胞因子,在肿瘤的免疫逃避中发挥重要作用。