一种多拷贝串联基因的链霉菌表达载体的构建方法

目的建立一种链霉菌外源基因多拷贝串联表达的载体构建方法。方法首先以链霉菌整合型载体p SET152为基础,构建表达载体p FIM001。该质粒携带链霉菌强启动子Perm E*,与下游外源基因组成表达盒;紧接着在载体p FIM001插入了tcs D基因构建质粒p FIM101,并且引入了XbaⅠ及SpeⅠ等位点;通过表达盒串联定向克隆法完成多拷贝tcs D的插入。结果成功构建外源多拷贝基因表达载体p FIM001,建立了表达盒串联定向克隆法,获得含不同拷贝tcs D基因的质粒。结论可以用这个方法构建多拷贝基因质粒。

重叠延伸PCR-酶切连接法构建链霉菌表达载体

在功能基因组学时代,对基因的功能研究将涉及到大量的载体构建,为建立一种链霉菌外源基因多拷贝表达的载体构建方法,本研究采用重叠延伸PCR与双酶切结合的连接方法,构建链霉菌表达载体,以红霉素工业生产菌红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)基因组DNA为模板,扩增红霉素合成相关的甲基化酶基因(erythromycin O-methyltransferase,eryG)和羟基化酶基因(erythromycin C-12 hydroxylase,eryK),以及启动子permE基因,采用重叠延伸PCR及EcoRⅤ、NotⅠ和XbaⅠ酶切位点相结合的连接方法构建含有多个基因片段的链霉菌重组表达载体。成功构建了携带外源基因的表达载体pSET001、pSET002和pSET003,最终获得含有多个基因的重组质粒。双酶切载体构建时载体或DNA片段上可用的限制性酶切位点受到限制,通过结合重叠延伸PCR技术,可以利用较少的内切酶快速构建含有多个基因片段的重组载体,为红霉素生产菌的改造提供了重组载体。

一个硫链丝菌素抗性基因标记、用于DNA导入链霉菌的pSET152衍生载体(英文)

【目的】在链霉菌PCR-targeting系统中,安普霉素是使用最普遍的选择标记。然而在基因敲除阶段利用安普霉素选择标记后,在遗传补偿时就不能使用相同选择标记的许多重要载体,如pSET152。这常给研究带来不便,特别是当研究对象基因如一些调控基因,其生理功能对剂量敏感时更是如此。基于此,拟以pSET152为基础构建一个不以安普霉素为抗性标记的通用整合型载体。【方法】利用融合PCR和λRed重组等方法构建载体。【结果】来自pHZ1358上的硫链丝菌素抗性基因tsr和来自pCR2.1的氨苄抗性基因bla以"tsr在前bla在后"的次序融合。融合后的抗性片段替换pSET152上的安普霉素抗性基因aac(3)-IV,从而获得新载体pGIM6626。利用该载体将删除的榴菌素最小聚酮合酶基因重新导入到Streptomyces vietnamensis突变株中,该突变株恢复了产榴菌素的能力,证实了该载体的有效性。【结论】构建了一个新的pSET152衍生载体pGIM6626。该载体包含氨苄和硫链丝菌素抗性基因,分别在大肠杆菌和链霉菌中作为选择标记。pGIM6626与pSET152用途相似,但前者由于与PCR-targeting系统不存在选择标记的冲突而与该系统更兼容。