重组质粒pSUPER-HBs RNAi的构建及筛选

目的:利用pSUPER-RNAi载体系统进行HBsRNAi序列的初步筛选和干扰效果鉴定。方法:设计并合成针对HBs基因区的3条siRNA(HBs-siRNA1、HBs-siRNA2、HBs-siRNA3),构建3种重组载体pSUPER-HBs-siRNA,与HBV质粒同时瞬转人胚肾293T细胞,72h后观察转染效果,实时定量PCR和ELISA法鉴定3种干扰序列对HBs的干扰效果,筛选最佳干扰序列。结果:成功构建3种干扰质粒pSUPER-HBs-siRNA,能高效转染人胚肾上皮细胞293T,转染效率在70%以上;实时定量PCR和ELISA法结果均显示HBs-siRNA2可有效抑制HBs的表达,抵制率可达80%,而HBs-siR-NA1、HBs-siRNA3干扰效果不显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建3种干扰质粒pSUPER-HBs-siR-NA,筛选出其中能有效抑制HBs基因表达的pSUPER-HBs-siRNA2序列,为后续研究奠定了基础。

抑制Smad3的pSUPER RNAi系统的构建和活性鉴定

目的:构建抑制Smad3的shRNA表达载体。方法:化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向Smad3的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到经BgLⅡ和HindⅢ双酶切同时经牛小肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,CIP)处理后的pSUPER载体的polyⅢH1启动子的下游,重组构建RNA干扰(RNA induced interference,RNAi)质粒,同时设立错义寡核苷酸作为非特异性对照。并将所构建的pSUPER Smad3转染到人类肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC),检测其抑制效果。结果:重组构建的pSUPER Smad3载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。体外活性鉴定表明其能成功地抑制Smad3的基因和蛋白表达,却不影响Smad2的表达。结论:载体成功构建,其在体外抑制效率高,且特异性好。

RNA干扰VEGF对体外JAR细胞生长的影响

利用pSUPER质粒作为载体,在人绒癌JAR细胞内成功的沉默了VEGF基因的表达,建立了稳定转染pSUPER-shVEGF1,pSUPER-shVEGF2干扰质粒的JAR细胞株.随后利用RT-PCR证实了在JAR细胞株中,VEGF基因的表达被抑制.显微观察及流式细胞学检测转染后细胞株克隆生长情况显示体外培养条件下VEGF基因受抑后JAR细胞生长周期无发生变化,提示VEGF在体外可能对JAR细胞增殖无直接作用.

p58^(IPK)基因RNA干扰载体的构建及鉴定

针对p58IPK基因设计2个靶位点,并根据靶位点合成2对寡聚核苷酸序列,退火后连接到经BglⅡ和HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,分别构建抑制p58IPK蛋白基因表达的p58IPK-siRNA1和p58IPK-siRNA2载体并鉴定其功能。重组构建的pSUPER-p58IPK载体经酶切鉴定及基因序列分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。将构建的2个RNAi载体分别转染到293T细胞中,通过Real-time PCR和Western blotting的方法检测其对p58IPK的抑制效果,结果证明p58IPK-siRNA2可显著抑制细胞中p58IPK基因的表达,可为进一步研究p58IPK在禽流感病毒感染中的作用机制奠定基础。