pSV-VEGF165肌内原位注射促进兔缺血后肢侧支血管形成

目的 为临床探索一种更简便安全的下肢动脉缺血性疾病的基因治疗途径。方法 建立兔后肢缺血动物模型 ,将体外构建的重组质粒 pSV VEGF16 5注射于缺血肌群 ,30d后行动脉造影并切取标本 ,测定毛细血管密度和毛细血管 /肌肉数比值。结果 经 pSV VEGF16 5治疗后 ,缺血肢体毛细血管密度和毛细血管 /肌肉数比值显著增加 ,小腿部位比大腿部位增加明显 ;动脉造影显示部分缺血肢体侧支动脉明显增多。结论 肌肉内原位注射 pSV VEGF16 5是一种简单有效的治疗基因转染途径 ,能显著增加缺血肢体侧支血管形成。

OIP5-AS1通过VEGF165调控ADSCs-Exos分泌促进创面愈合的研究

目的探讨敲低Opa相互作用蛋白5-反义转录物1(opa-interactingprotein 5 antisense RNA 1,OIP5-AS1)的脂肪间充质干细胞外泌体(exosomes derived from ADSCs,ADSCs-Exos)在创面愈合中的作用机制。方法选取2024年2月至6月期间在延安大学附属医院接受选择性吸脂或手术整形的10例人体正常皮下脂肪组织,从中分离脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cell,ADSCs),提取外泌体,并鉴定外泌体标志蛋白肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)和CD9的表达。使用实时荧光定量聚合酶链式反应测定OIP5-AS1的表达。采用H_(2)O_(2)处理人永生化表皮细胞HaCaT,构建体外皮肤损伤模型。MTT法和流式细胞术检测细胞活力和凋亡。采用t检验、方差分析进行统计比较。结果ADSCs-Exos增加H2O2处理的HaCaT细胞活力,抑制细胞凋亡(t=4.358、5.654,均P<0.05)。与ADSCs相比,OIP5-AS1在ADSCs-Exos中表达显著上调(t=4.125,P<0.01),且敲低OIP5-AS1抑制了ADSCs-Exos对创面愈合的修复作用(t=3.367、6.674,均P<0.05)。敲低OIP5-AS1后抑制了血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)的表达(t=3.105,P<0.01),VEGF165过表达可部分逆转敲低OIP5-AS1对创面愈合的抑制作用(t=3.327、5.544,均P<0.05)。结论敲低OIP5-AS1的ADSC-Exos通过调控VEGF165的表达影响创面愈合过程,为皮肤创面愈合的治疗提供新靶点。

支架携带pSV-VEGF_(165)基因促进内皮修复的实验研究

目的评估通过支架向兔颈动脉壁转染pSV -VEGF165基因促进内皮修复的疗效。 方法采用自制支架导送系统 ,由生物凝胶介导 ,将携带质粒 pSV -VEGF165的支架植入兔一侧颈动脉段 ,对侧植入携带质粒 pSV - β- gal的支架作对照。通过RT -PCR、免疫组化染色及扫描电镜 ,观察局部动脉壁外源VEGF基因、蛋白的表达及内皮修复情况。 结果RT -PCR检测证实 ,支架植入术后 1d ,VEGF基因转染动脉段有VEGFmRNA的表达 ;7d表达达高峰。免疫组化染色显示 ,术后 3d外源VEGF蛋白表达 ,表达时间延迟于基因表达 ,但表达趋势与基因表达一致。扫描电镜显示 ,治疗组内皮完全修复时间提前至术后 1月。 结论采用支架携带基因的方法能成功将 pSV -VEGF165基因转移至血管壁 ,血管壁细胞能摄取基因 ,并表达具有生物学功能的蛋白质 ,促进内皮修复。

血管内皮生长因子165/骨形态发生蛋白改善缺氧复氧状态下成骨细胞损伤

背景:研究发现,血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白两种因子在缺氧复氧过程中相互作用,通过调节细胞内信号通路的活化,参与骨细胞损伤的修复过程。目的:进一步探究血管内皮生长因子165/骨形态发生蛋白与缺氧复氧成骨细胞损伤的关系分析。方法:取成骨细胞,建立缺氧复氧损伤模型,建模前后Real-Time PCR法和免疫印迹法检测血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白2的mRNA及蛋白表达。分别给予建模后成骨细胞不同质量浓度(10,20,40ng/mL)血管内皮生长因子165或骨形态发生蛋白2处理12,24,36,48,72 h,CCK-8法检测细胞增殖,DAPI检测细胞凋亡。结果与结论:(1)与建模前相比,建模后成骨细胞中血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白2的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05);(2)成骨细胞增殖率随着血管内皮生长因子165质量浓度的升高而明显升高(P<0.05);成骨细胞凋亡率随着血管内皮生长因子165质量浓度的升高而明显降低(P<0.05);(3)成骨细胞增殖率随着骨形态发生蛋白2质量浓度的升高而明显升高(P<0.05);成骨细胞凋亡率随着骨形态发生蛋白质量浓度的升高而明显降低(P<0.05);(4)结果表明,血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白在缺氧复氧成骨细胞损伤中低表达,给予血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白处理后缺氧复氧成骨细胞损伤明显降低,且呈浓度依赖性,提示血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白对缺氧复氧成骨细胞损伤有明显保护作用。

骨髓CD11b^(+)巨噬细胞分泌VEGF-A165b抑制老年小鼠新血管形成的作用机制

目的探讨老年小鼠缺血组织中骨髓(BM)源性CD11b^(+)巨噬细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)-A165b抑制老年小鼠新血管形成的作用机制。方法制备8周龄小鼠(对照组)和>72周龄小鼠(观察组)后肢缺血模型,每组6只,分别于术前、术后第0、4、7、14天用激光散斑血流成像(LSBFI)评估血流恢复状态。采用免疫组织化学染色方法于术后第4天,对巨噬细胞(Mac-3)进行染色,计算巨噬细胞数量,于第14天对CD31+巨噬细胞进行染色检测两组缺血后肢肌肉中毛细血管密度。采用Western印迹,于术后第4天检测两组缺血肌肉组织中VEGF-A、丝氨酸精氨酸蛋白剪接因子(SC35)、Wnt5a蛋白表达水平。采用实时荧光聚合酶链反应(RT-qPCR)于术后第4天检测两组缺血肌肉组织中BM源性CD11b^(+)巨噬细胞裂解物及缺血肌肉中VEGF-A165b、Wnt5a mRNA水平。采用含有观察组BM源性CD11b^(+)巨噬细胞的特殊培养液在缺氧条件下培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)24 h,计算每个板口的6个区域中出芽数量和长度评估CD11b^(+)巨噬细胞分泌的VEGF对血管生成的影响。结果LSBFI显示,观察组后肢缺血呈现低灌注信号(深蓝色),而对照组呈现高灌注信号(红色)。与对照组相比,观察组缺血后肢肌肉中毛细血管密度明显降低(P<0.05)。与对照组相比,观察组缺血肌肉组织中VEGF-A、SC35、Wnt5a蛋白表达水平明显升高,观察组BM源性CD11b^(+)巨噬细胞中及缺血肌肉组织中VEGF-A165b、Wnt5a mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。HUVEC芽的数量和长度,与不含有观察组小鼠BM源性的CD11b^(+)巨噬细胞的培养液相比,其生长明显受到抑制(P<0.05)。结论衰老可通过VEGF-A165b机制损害缺氧组织的新血管形成,其机制可能由Wnt5a-SC35信号通路介导。

非洲猪瘟病毒C129R蛋白与E165R蛋白的可溶性表达、胞外酶活力测定与结构预测分析

C129R和E165R分别是非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组编码的一种Mn依赖的超氧化物歧化酶和尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶,2种酶均参与ASFV的复制过程。通过研究ASFV C129R蛋白与E165R蛋白的功能,以指导非洲猪瘟的诊断及免疫预防研究。对ASFV SY-18株的C129R和E165R基因序列进行密码子优化后,利用大肠杆菌进行表达,纯化后获得重组蛋白,通过Western blot鉴定其反应性,并对其胞外酶活力进行测定,对C129R蛋白的结构预测结果进行分析。结果:实现了C129R蛋白与E165R蛋白的可溶性表达,重组蛋白分子量分别约为15 kDa和18 kDa, Western blot显示C129R与E165R蛋白均能与ASFV阳性血清产生特异性反应;胞外酶活力测定显示,C129R与E165R蛋白在胞外均有酶学活性,比酶活力分别为(60.2±3.8) U/mg和(32.6±2.4) U/mg;蛋白质结构预测结果显示,C129R为双结构域蛋白,主要由N端α螺旋结构域和C末端α/β结构域组成,C129R蛋白N端α螺旋结构域和C末端α/β结构域的交界处可能是其主要活性位点,序列保守的β-折叠桶(K_(32)~A_(101))可能在其发挥功能时起重要作用。

血管内皮生长因子165b对人肝癌HepG_2细胞生物学特性的影响

目的:探讨血管内皮生长因子165b(VEGF165b)对人肝癌HepG_2细胞生物学特性的影响,并初步研究其作用机制。方法:HepG_2细胞分为空白组(仅加转染试剂)、对照组(转染阴性对照PcDNA3.0表达载体)和PcDNA-VEGF165b组(转染VEGF165b表达载体PcDNA-VEGF165b)。MTT法检测各组HepG_2细胞生存率,RT-PCR法和Western blotting法检测HepG_2细胞中VEGF165b和VEGF165 mRNA和蛋白表达水平,Transwell小室法检测HepG_2细胞迁移能力。结果:与空白组比较,对照组HepG_2细胞中VEGF165b和VEGF165mRNA和蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。与空白组比较,PcDNA-VEGF165b组细胞中VEGF165bmRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05),VEGF165 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。空白组和对照组细胞生存率比较差异无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,PcDNAVEGF165b组细胞生存率有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。细胞迁移实验,空白组和对照组细胞迁移率比较差异无统计学意义(P<0.05);与空白组和对照组比较,PcDNA-VEGF165b组HepG_2细胞迁移率明显降低(P<0.05)。结论:VEGF 165b能抑制VEGF165基因和蛋白的表达,VEGF165b对肝癌细胞增殖无明显影响,但可降低肝癌细胞的迁移能力。

血管内皮生长因子165基因对人胃癌细胞凋亡的影响及机制

目的:本实验探讨血管内皮生长因子165(VEGF165)对体外培养的胃癌细胞株BGC-823凋亡的影响和机制.方法:将BGC-823细胞分为对照组、感染复数(MOI=20)病毒Ad-GFP的Ad-GFP组,重组腺病毒Ad-VEGF165转染的Ad-VEGF165组.应用流式细胞仪检测细胞凋亡的百分率,RT-PCR方法检测凋亡抑制基因Bcl-2mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测Bcl-2蛋白的表达情况.结果:流式细胞仪测定显示Ad-VEGF165组的细胞凋亡率明显低于Ad-GFP组和对照组(4.6%±0.31% vs 8.37%±1.06%.7.73%±0.86%,P<0.01);RT-PCR和细胞免疫化学结果显示VEGF165转染BGC-823细胞后促进了细胞Bcl-2mRNA和蛋白的表达.Ad-VEGF165组Bcl-2mRNA和蛋白均高于对照组和Ad-GFP组(Bcl-2mRNA:0.761±0.05 vs 0.363±0.12.0.356±0.08;Bcl-2蛋白:1.010±0.08 vs 0.865±0.07,0.901±0.05;P<0.01).结论:VEGF165通过上调凋亡抑制基因Bcl-2及其蛋白的表达,来抑制血浆饥饿诱导的胃癌细胞的凋亡.

VEGF165反义RNA对人食管鳞癌细胞影响的实验研究

目的 :观察血管内皮生长因子16 5 (VEGF16 5 )反义RNA对人食管鳞癌细胞EC10 9的影响 ,探讨其治疗食管癌的可行性。方法 :采用亚克隆技术 ,构建并鉴定VEGF16 5 反义RNA的真核表达载体。以重组质粒转染人食管鳞癌细胞EC10 9后 ,将其接种于裸鼠皮下 ,分别利用原位杂交、激光共聚焦、图象分析及微血管计数等方法 ,观察转染前后EC10 9细胞的生物学性状和致瘤性。结果 :成功地构建了VEGF16 5 反义RNA的真核表达载体 ,并在EC10 9细胞中获得表达。转染细胞中VEGF16 5 的表达下降 75% ,其生物学性状不受外源基因表达的影响 ,但其在裸鼠皮下的致瘤性和和瘤组织中血管的生成明显下降。VEGF16 5 反义RNA转染组、空载体转染组和对照组中肿瘤的体积 ,分别为 (82 0± 112 .5)mm3 、(793 0± 10 3 5)mm3 和 (7850± 950 )mm3(P <0 .0 1) ;微血管的密度分别为 (8.5± 1.2 ) /mm2 、(44.3± 9.4) /mm2 和 (46.4± 12 .6) /mm2 (P <0 .0 1)。结论 :VEGF16 5反义RNA能够明显减少食管鳞癌细胞内VEGF16 5 的表达 ,具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用 ,可望用于实体肿瘤的辅助治疗。

人VEGF165基因真核表达质粒的构建及其对血管内皮细胞增殖的影响

目的 :构建人VEGF16 5基因的真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5 ,观察其在血管内皮细胞 (VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响。方法 :用RT PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF16 5基因 ,并将其克隆至真核表达质粒pBud CE4 .1中 ,对重组真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5进行酶切鉴定和测序。以脂质体转染法将pBudCE4 .1/VEGF16 5导入VEC中 ,用Northernblot和免疫细胞化学染色法 ,分别从mR NA水平和蛋白质水平检测它们在转染的VEC中的表达 ,并检测表达产物对VEC增殖的影响。结果 :人VEGF16 5基因的RT PCR产物为 5 76bp。测序结果显示 ,扩增的VEGF16 5基因的序列与基因文库中登录的序列完全一致。经HindⅢ和BamHI酶切鉴定证实 ,VEGF16 5基因已成功地克隆至真核表达质粒pBudCE4 .1中。以其转染血管内皮细胞 (VEC)后 ,经Northernblot杂交和免疫细胞化学染色法检测均证实VEGF16 5基因表达。表达产物对VEC增殖有明显的促进作用。结论 :所构建的pBudCE4 .1/VEGF16 5真核表达质粒可在VEC中表达 ,表达产物可明显促进VEC增殖 ,为通过VEGF16

APP5肽类似物165对老年性痴呆模型大鼠行为学及PSD95和Shank 1表达的影响

目的观察5肽类似物165对老年性痴呆(Alzhei mer disease,AD)模型大鼠学习记忆能力及突触后致密区蛋白95(postsynaptic density95,PSD95)和骨架蛋白Shank1表达的影响。方法将45只大鼠随机分为正常对照组、模型组和5肽类似物165治疗组,模型组和治疗组大鼠按体重3mg/kg行双侧侧脑室链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射,第3天重复注射建立AD模型,对照组以人工脑脊液代替STZ。术后21d治疗组按体重0.34mg/(kg.d)给予APP5肽类似物165灌胃干预,其余两组以蒸馏水代替。3周后应用Morris水迷宫、免疫组织化学和Western blotting方法检测大鼠的学习记忆能力及PSD95和Shank1的表达。结果5肽类似物165治疗组大鼠的平均游泳时间较模型组明显缩短(P<0.01),且海马PSD95和Shank1阳性神经细胞数及PSD95和Shank1蛋白表达较模型组明显增加(P<0.05)。结论5肽类似物165可显著提高大鼠学习记忆能力,增加大鼠海马PSD95和Shank1表达,表明其对突触功能和可塑性具改善作用。

重组人VEGF_(165)工程菌的发酵及表达产物的纯化与活性测定

目的 :优化重组人VEGF1 65(rhVEGF1 65)工程菌的发酵条件 ,分离纯化目的蛋白并检查活性。方法 :考察了甲醇诱导浓度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响 ;发酵液经离心、透析后 ,经肝素亲和柱层析、超滤制得纯品 ;采用CAM实验和血管内皮细胞MTT法测定生物活性 ,比较了与人VEGF1 65标准品的免疫原性。结果 :最佳表达条件为 :甲醇诱导浓度为 1% ,诱导时间为 5～ 6d ;采用Heparin SepharoseCL6B亲和层析后 ,产物纯度可达 90 %以上 ;活性测定结果显示 ,目的蛋白具有促血管生成作用 ;与人VEGF1 65具有相似的免疫原性。结论 :经发酵纯化后获得了有活性的重组人VEGF1

FCS165现场总线控制系统实际微分PID控制器的设计

在分析PID控制器设计常用的理想微分PID控制算法和实际微分PID控制算法的基础上,选择实际微分PID控制算法用于FCS165现场总线控制系统,并给出了抗积分饱和无扰动切换的方案。经长期测试和实际运行表明,实际微分PID控制算法控制效果较好。

APP5肽类似物P165对链脲佐菌素双侧侧脑室注射大鼠海马神经元突触的保护作用

目的观察APP5肽类似物P165对双侧侧脑室注射链脲佐菌素(STZ)大鼠海马神经元突触相关蛋白表达的影响。方法雄性Wistar大鼠45只,随机分为对照组、模型组和治疗组。模型组、治疗组大鼠脑室注射STZ制作痴呆模型,3周后,治疗组以APP5肽类似物P165灌胃治疗,用药4周后,采用Morris水迷宫进行行为学测试;免疫组织化学染色及Western blotting方法观察突触素、α-突触核蛋白和突触后致密区-95蛋白(PSD-95)的表达;电镜观察海马CA1区超微结构改变。结果模型组游泳时间显著长于对照组和治疗组。免疫组织化学染色及Westernblotting均显示模型组海马内突触素、PSD-95蛋白表达与对照组和治疗组相比显著减少,而α-突触核蛋白显著增多。电镜观察可见模型组海马CA1区神经元出现退行性改变,神经毡内突触结构异常。结论脑室注射STZ可影响大鼠海马突触相关蛋白的表达,引起海马神经元和突触的超微结构病变,导致大鼠学习记忆能力减退。APP5肽类似物P165可影响突触蛋白的表达,改善突触功能,有助于恢复大鼠的学习、记忆能力。

抗人VEGF165单链抗体的构建与表达

目的为降低鼠源抗体对人体的免疫原性 ,构建表达了 Vm D11的单链抗体。方法用 overlap PCR构建出单链抗体的基因 ,克隆入表达载体 p Kp L- 3a,在大肠杆菌 pop2 136中表达 ,采用抗原结合 EL ISA和竞争抑制 EL ISA测定活性。结果经SDS- PAGE检测 ,诱导后的细菌表达了 2 6 k D的蛋白 ;Western Blot证实该蛋白为表达的单链抗体。经变性、复性后 ,该单链抗体可特异结合人 VEGF16 5抗原 ,并与 Vm D11具有相同的抗原结合位点。结论成功构建和表达了抗人 VEGF16 5单链抗体 ,可望进一步应用于肿瘤复发转移的诊治研究。

鸡RNF165蛋白多克隆抗体制备及其生物信息学分析

【目的】制备鸡环指蛋白165(RNF165)多克隆抗体并对RNF165蛋白进行生物信息学分析,以期为研究鸡RNF165的生物学功能提供参考。【方法】以鸡胚成纤维细胞(DF-1)为试验材料,提取总RNA,反转录获得cDNA,通过PCR扩增RNF 165基因,将其连接至pET-28a(+)质粒构建重组表达质粒pET-28a-RNF165。将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,将表达的融合蛋白纯化后按照制定的免疫程序免疫7周龄BALB/c雌鼠。第3次免疫7 d后,分离小鼠血清,用Western blotting检测鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定其效价。使用在线生物信息学软件对RNF165蛋白理化性质、信号肽、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构、二级结构和保守结构域进行分析。【结果】成功扩增得到大小为1068 bp的RNF165基因。成功构建原核表达载体pET-28a-RNF165,并诱导表达出约43 ku的RNF165蛋白。Western blotting结果显示,制备的鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的RNF165蛋白,效价为1∶32000。生物信息学分析结果显示,RNF165蛋白由350个氨基酸组成,分子质量为39.88 ku,等电点为7.13,不稳定指数为69.87,为亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜结构域,有29个磷酸化位点;RNF165蛋白二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成;RNF165出现在细胞核内的概率最高,为47.8%;RNF165蛋白质C-端296―341位氨基酸残基为RING-Ubox超家族保守结构域。【结论】本研究所制备的鼠抗RNF165多抗隆抗体具有较高的反应性和特异性,RNF165蛋白为亲水性蛋白,主要在细胞核内表达,结果可为研究RNF165蛋白的生物学功能提供材料支持。

食管鳞癌中VEGF_(165b)、HIF-1α的表达及临床意义

目的检测食管鳞癌组织中VEGF165b和HIF-1α的表达及与临床病理特征的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测143例食管鳞状细胞癌组织中VEGF165b和HIF-1α的表达。结果VEGF165b和HIF-1α在食管鳞癌组织中的阳性表达率分别为13.3%和43.4%;VEGF165b阳性表达率与HIF-1α阳性表达率呈负相关关系(P=0.035)。HIF-1α阳性表达率与饮酒程度、分期、纵隔淋巴结转移及肿瘤的分化程度呈正相关(P<0.05)。结论VEGF165b和HIF-1α在食管癌的发生发展和淋巴转移中起重要的作用,VEGF165b的表达与HIF-1α存在相关性,饮酒是食管癌的重要危险因素。VEGF165b可能成为治疗的靶点。

应用LP165P模型分析月球重力场特征及其对绕月卫星轨道的影响

通过现有的最新月球重力场模型LP165P和GLGM2模型对月球重力场的特征进行了分析,计算了相应重力场的阶方差,给出了两种模型在月球外部空间不同高度上的重力异常分布图,分析比较了截断至不同阶次的月球重力场模型在不同高度上所反映的月球重力场的特征和差异.此外,利用GSFC NASA USA的GEODYNⅡ轨道分析软件模拟计算了不同高度处卫星的轨道变化,得出了在进行一定高度的轨道计算时,可以对重力场模型进行适当截断的结论.

重组人血管内皮生长因子165在Pichia酵母中的表达

目的 :采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF1 65蛋白。方法 :自人肿瘤组织中获取人VEGF1 65cDNA ,构建pPIC9K酵母表达载体 ,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果 :SDS PAGE及Western blot结果显示目的蛋白已成功表达。结论 :在Pichia酵母中成功表达人VEGF1 65。

VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。