小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子真核表达载体pSecTag2B-msBlyS的构建

目的 克隆BALB c小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子 (msBlyS)的cDNA片段并测序分析 ,为研究msBlyS诱导的抗肿瘤作用提供目的基因。方法 采用反转录聚合酶联反应 (RT_PCR)法从BALB c小鼠脾脏组织总RNA中获得 5 6 6bp的msBlyS基因cDNA。通过TA克隆测序无误 ,再将其定向连接到pSecTag2B真核表达载体上 ,转化E .coliXL1_blue。限制性内切酶筛选出阳性克隆pSecTag2B_msBlyS ,末端终止法完成msBlyScDNA的序列测定。结果 测得的msBlyScDNA序列与基因文库中报道序列完全相同 ,插入相位正确 ,未改变目的基因的阅读框架。结论 成功克隆了小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子基因 ,为研究其诱导的抗肿瘤作用奠定了基础。

可诱导共刺激分子和小鼠免疫球蛋白融合基因的分泌表达及生物学活性

目的：为获得重组可诱导共刺激分子胞外段与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白（ICOS-Ig）并研究其生物学活性，以探讨它作为免疫拮抗剂阻断ICOS／B7RP-1共刺激通路的作用。方法：克隆编码人可诱导共刺激分子（ICOS）胞外片段，与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合，构建ICOS-Ig融合基因及其分泌型真核表达载体pSecTag2／Hygro A-ICOS-Ig；构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株，用Western blot和ELISA法检测其表达、流式细胞仪（FACS）检测其配体结合活性、混合淋巴细胞反应（MLR）及细胞因子检测测定其生物学活性。结果：核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸与Genebank序列一致：ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达，其含量可达5～25μg／ml；该重组蛋白有配体结合活性，可体外抑制淋巴细胞增殖、减少IL-2、IFN-γ的分泌。结论：重组ICOS-Ig融合基因及其真核表达载体的构建完成并获得高效表达，该重组蛋白具有配体结合活性，可在体外通过抑制ICOS／B7RP-1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。

人骨骼肌TnI-fast基因克隆和体外表达

目的 构建人骨骼肌TnI fast基因分泌型真核表达载体 ,为利用TnI fast基因进行抗肿瘤血管生成基因治疗奠定基础。方法 采用PCR和RT PCR制备TnI fastcDNA ,构建TnI fast基因克隆质粒 ,测序证实后将TnI fastcDNA插入到pSecTag2B构建分泌型重组真核表达质粒。然后用TnI fast基因重组表达质粒转染COS 1细胞 ,检测TnI fast基因体外表达。结果 DNA测序证实 ,我们从人骨骼肌总RNA和cDNA文库中扩增的TnI fastcDNA序列与NCBIGenebankTnI fastcDNA序列完全一致。ELISA检测证实 ,TnI fast pSecTag2B转染后目的基因可在真核细胞中分泌表达。结论 本研究成功地构建了TnI fast基因重组表达质粒 。

基因重组免疫毒素白细胞介素18-PE38融合基因治疗类风湿性关节炎的初步研究

目的 构建白细胞介素18(interleukin18,IL- 18) - PE38融合基因的真核表达载体,并研究其在小鼠软骨细胞及3T3细胞中的表达,探讨类风湿性关节炎的基因治疗方法。 方法 经限制性内切酶双酶切从质粒PRKL4 5 9K- IL18- PE38中获取IL- 18- PE38融合基因,将其与真核表达载体Psec Tag2 B连接,转化感受态菌,挑取单克隆培养并提取质粒,Eco R 单酶切鉴定。脂质体转染法将构建的真核表达载体转染入3T3细胞及小鼠软骨细胞中,分别设置空载体对照,通过荧光免疫细胞化学法鉴定转染后瞬时表达情况。 结果 Eco R 单酶切后电泳鉴定显示,所构建的真核表达载体Psec Tag2 B- IL- 18- PE38片段长度约为6 0 0 0 bp。荧光免疫细胞化学法、荧光显微镜摄片均显示转染融合基因组荧光表达强,空载体对照组荧光表达微弱。 结论 IL- 18- PE38融合基因真核表达载体构建成功,并在小鼠软骨细胞及3T3细胞中表达,为类风湿性关节炎的基因治疗研究奠定基础。