Lipofectamine2000转染pSiRNA-STAT3质粒对脑神经胶质瘤C6细胞的作用

目的研究Lipofectamine2000下转染p SiRNA-STAT3质粒对脑神经细胞C6的作用。方法取对数生长期的C6细胞随机分为Mack组、Scramble组和p SiRNA-STAT3组采用MTT法检测C6细胞在不同时间段(6、8、10 h)细胞增殖活性;荧光显微镜观察吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)检测细胞凋亡及线粒体膜电位变化。结果 Lipo2000转染p SiRNA-STAT3质粒在8 h时对C6细胞具有明显的抑制作用;镜下观察p SiRNA-STAT3组可见典型的细胞凋亡形态学特征性改变;线粒体膜电位显著降低。Mock组与Scramble组比较无统计学意义(P>0.05);p SiRNA-STAT3组与Scramble组比较差异显著(P<0.05)。结论 Lipo2000转染p SiRNA-STAT3质粒可能通过降低线粒体膜电位,抑制肿瘤细胞增殖并促进细胞凋亡,发挥抗肿瘤生长的作用。

沙眼衣原体质粒编码蛋白3的致病性及免疫保护性研究

目的 探索沙眼衣原体(CT)质粒编码蛋白3(Pgp3)的致病性及免疫保护性。方法 CT L2构建株(GFP)、野生株(WT)和质粒缺失株(PF)分别感染Hela细胞,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)和间接免疫荧光法(IFA)检测Pgp3蛋白表达水平;L2 GFP、WT和PF菌株经阴道分别感染C3H小鼠,感染后不同时间点经IFA评估生殖道包涵体形成单位(IFU)数量;组氨酸标记的Pgp3(His-Pgp3)体外刺激人输卵管上皮细胞,24 h后经Hoechst 33 528染色和流式细胞术检测细胞凋亡情况;L2 WT体外感染L929和L929-Pgp3细胞,在感染后30、60及80 h固定细胞并计算IFU和细胞核数量。L2 GFP和WT菌株经阴道分别感染C3H小鼠,50 d后各组均以L2 WT菌株攻毒,攻毒后不同时间点评估生殖道IFU数量。结果 L2 GFP Pgp3蛋白表达水平高于L2 WT,L2 PF无Pgp3蛋白表达;小鼠感染后第3、7、10和14天,L2 GFP感染组IFU数量显著高于L2 WT和L2 PF感染组,且L2 GFP组感染周期最长;Pgp3体外干预组细胞凋亡率显著低于空白组,L2 WT体外感染L929和L929-Pgp3细胞60 h和80 h后,L929-Pgp3组IFU值显著高于L929组,且宿主细胞消亡数量显著低于L929组;动物实验显示L2 GFP组经L2 WT菌株攻毒后下生殖道IFU数量显著低于L2 WT组,且L2 GFP组感染周期显著短于L2 WT组。结论 Pgp3可抑制宿主细胞凋亡并促进CT在细胞间播散感染;内源性Pgp3有良好的免疫保护性。

EML3与H3K4M融合蛋白表达质粒的构建及蛋白的表达与纯化

目的:研究获得N端/C端融合组蛋白H3K4M小肽的EML3融合蛋白的方法。方法:将组蛋白H3(aa1~15)小肽编码区融合进表达EML3 Agenet结构域重组质粒中,得到N端/C端融合表达H3K4M的质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经扩大培养,加入IPTG后在15℃条件下诱导6×His标签EML3融合蛋白的表达。经镍柱亲和层析及凝胶过滤层析进行纯化后,通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测蛋白的纯度。结果:通过质粒单点突变、质粒酶切、PCR克隆以及同源重组连接,成功构建EML3 N/C端融合组蛋白H3K4M的重组质粒,测序证实序列正确,而且重组质粒可在大肠杆菌中成功诱导融合蛋白的表达。其中EML3C端融合组蛋白H3K4M可通过凝血酶酶切从而得到游离的H3K4M小肽以及EML3 Agenet结构域蛋白。结论:成功构建EML3融合组蛋白H3K4M重组质粒,并诱导表达及纯化得到高纯度的EML3融合蛋白。

Lipofectamine2000转染psiRNa-STAT3质粒对乳腺癌细胞作用的影响

目的研究Lipofectamine2000转染psiRNa-STAT3质粒对4T1细胞侵袭及凋亡的作用。方法 Transwell小室检测psiRNa-STAT3质粒对乳腺癌细胞侵袭能力影响,Western-blot检测Cyclin-D1、Caspase-3蛋白表达水平。结果 Mock组与Scramble组穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05),psiRNa-STAT3组穿膜细胞数与Scramble组比较差异有统计学意义(P<0.05);western-blot检测Scramble组Cyclin-D1、Caspase-3蛋白表达水平与Mock对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。psiRNa-STAT3组Caspase-3及Cyclin-D1蛋白表达量与Scramble组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 psiRNa-STAT3质粒可能通过下调Caspase-3、Cyclin-D1蛋白表达从而抑制乳腺癌细胞侵袭能力,诱导细胞凋亡。

Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A 3种质粒稳转HepG2细胞株的建立与功能研究

目的建立Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A 3种质粒稳转HepG2细胞株,探究单纯转染3种质粒及选择性上调p Smad3C、p Smad3L对HepG2细胞功能的影响。方法采用脂质体转染试剂盒将Smad3 WT(野生型Smad3基因)、Smad3 EPSM(Smad3L区磷酸化位点突变)、Smad3 3S-A(Smad3C区磷酸化位点突变)3种质粒转染至HepG2细胞中,经G418筛选阳性细胞,Western blot法鉴定3种质粒稳转细胞株的转染效率。MTT法检测细胞增殖情况。流式细胞术检测细胞周期及凋亡。结果 Western blot结果显示,转染相应质粒的HepG2细胞高表达目的蛋白,提示稳转细胞株构建成功。MTT结果显示,在缺乏TGF-β_1刺激情况下,转染3种质粒后对HepG2细胞增殖几乎没有影响,TGF-β_1能够诱导稳转细胞株的细胞增殖,且转染Smad3 EPSM质粒的HepG2细胞,较未转染、转染Smad3 WT或Smad3 3S-A质粒的HepG2细胞对TGF-β_1诱导的细胞增殖反应减弱。细胞周期分析显示,TGF-β_1刺激下,转染Smad3 EPSM质粒组G_0/G_1期细胞数明显增多,而转染Smad3 3S-A质粒组G_2/M期细胞数增加明显。细胞凋亡检测显示,TGF-β_1刺激下,较未转染和转染Smad3 WT质粒组,转染Smad3 EPSM质粒组细胞凋亡率明显增加,而转染Smad3 3S-A质粒组细胞凋亡率明显降低。结论成功建立Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A 3种质粒稳转HepG2细胞株,为进一步探讨开发能够经由调控p Smad3C、p Smad3L的药物提供一定的基础。

鸡堆形艾美球虫3-1E基因真核表达质粒的构建及其抗球虫免疫保护作用

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从堆形艾美球虫SH株子孢子中扩增3-1E基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-3-1E。质粒纯化后体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光技术和免疫组织化学技术检测3-1E蛋白在转染细胞中的表达情况。将构建的重组质粒以及空载体质粒分别于14、21日龄分2次经腿部肌肉注射免疫SPF雏鸡,28日龄除非免疫非感染对照组外各组攻击性感染5×104个堆形艾美球虫孢子化卵囊,观察真核表达质粒对球虫感染鸡的免疫保护作用并探讨其免疫保护机理。结果显示,与载体对照组相比,质粒pcDNA3.1(+)-3-1E 2次免疫后可显著提高脾CD8+T淋巴细胞亚型数量,并具有一定的抗球虫免疫保护作用,可显著减少每克粪便的卵囊排出量,降低十二指肠病变记分,减少增重下降等。

人3型腺病毒六邻体基因表达质粒的构建及表达

目的 表达人腺病毒 3型六邻体蛋白 ,为制备基因工程疫苗打下基础。方法 BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组克隆质粒pUC19Hexon和载体pQE31,将得到的目的片段定向连接到表达载体pQE31中 ,对目的片段进行DNA测序鉴定 ,IPTG诱导高效表达。结果 构建了表达重组质粒pQE31Hexon ,测序鉴定了克隆序列的准确性。在大肠杆菌中成功地表达了Ad3六邻体蛋白。结论 成功表达了Ad3的六邻体蛋白。

表达反义hREV3基因片段的真核细胞表达质粒的构建

目的：构建真核细胞表达重组体，为今后利用反义核酸阻断技术研究ｈＲＥＶ３ 基因功能及其与细胞遗传不稳定性的关系提供物质材料。方法：用内切酶Ｂａｍ ＨＩ及Ｂａｍ ＨＩ＋ Ｈｉｎｄ Ⅲ分别对ｐＢＳ－ ｈＲＥＶ３ 进行单酶切和双酶切，从而得到含ｈＲＥＶ３ ｃＤＮＡ 特异性保守序列的两种长度（７４２ｂｐ 和３５７ｂｐ） 片段，分别将两者插入真核细胞表达载体：ｐＢＫ－ＲＳＶ（ 持续表达载体） 和ｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐ － （ 表达需经地塞米松诱导） 。结果：经酶切图谱分析，筛选出含正向和反向插入片段真核细胞表达重组体５ 种。结论：为深入研究ｈＲＥＶ３

生长抑素pcDNA3s/SS质粒的构建与鉴定

动物生长抑制激素 (Somatostatin ,SS)基因克隆至含有乙肝表面抗原的 pcDNA3s质粒载体上 ,生长抑素基因插入到乙肝表面抗原的 5′末端 ,构建生长抑素DNA疫苗 .经PCR反应扩增出含有SS和HBsAg的融合基因片段 ,并经测序证实SS基因已成功重组到

草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建

构建草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR的标准品和标准曲线。通过培养草菇菌丝,提取总RNA并逆转录为cDNA后进行PCR扩增,电泳后纯化产物,T-A克隆,测序,获得了预期质粒,提取质粒,梯度稀释构建标准曲线,取得了满意结果。为利用实时荧光定量PCR技术研究草菇冷诱导Cor3基因的表达奠定了基础。

重组质粒pcDNA3-β-NGF的构建及其转染小鼠骨髓间充质干细胞生物学活性的研究

目的:构建人神经生长因子β亚基(β-NGF)真核表达载体,转染荧光小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学活性。方法:全骨髓贴壁培养法分离、培养和纯化荧光小鼠MSCs,构建真核表达载体pcDNA3-β-NGF,并转染MSCs;免疫组织化学染色检测β-NGF的表达,观察β-NGF阳性的MSCs对小鼠海马神经元生长的作用。结果:荧光小鼠MSCs可发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。重组质粒pcDNA3-β-NGF转染MSCs后β-NGF阳性率为(37.12±2.14)%,高于MSCs组[(2.36±0.62)%]和空白对照组[(1.43±0.76)%],差异有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3-β-NGF转染MSCs上清液培养的新生小鼠海马神经元的突起长度[(31±3)μm]较pcDNA3转染MSCs组[(23±4)μm]明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),表明β-NGF基因转染MSCs培养上清液中的产物能促进小鼠海马神经元的突起生长,具有明显的生物学活性。结论:成功构建了pcDNA3-β-NGF真核表达载体,其转染的荧光小鼠MSCs能正确、稳定表达和分泌有生物学活性的β-NGF。

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 。

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活NALP3炎性复合体诱导THP-细胞产生IL-1β和IL-18

目的:探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5质粒蛋白对IL-1β和IL-18等促炎性细胞因子的诱生作用,并初步分析其分子机制。方法:用0、3、6、12、24、36μg/ml不同浓度的pORF5蛋白刺激THP-1细胞,并于0、8、16、24、36 h收集上清及细胞,ELISA检测IL-1β和IL-18的含量;Realtime-PCR检测NALP3炎性复合体mRNA表达水平,Western blot鉴定Caspase-1活化状态;分别用NALP3 siRNA、ASC siRNA转染THP-1细胞24 h或用Caspase-1特异性抑制剂(Z-YVADFMK)预处理THP-1细胞30 min后,再用24μg/ml的pORF5质粒蛋白刺激THP-1细胞24 h,ELISA分析各处理因素对IL-1β和IL-18产生的影响。结果:pORF5质粒蛋白以浓度依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β和IL-18。当pORF5质粒蛋白浓度为24μg/ml时,IL-1β和IL-18的表达水平最高,分别为491 pg/ml、186 pg/ml;同时pORF5质粒蛋白以时间依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β和IL-18,两者分别在24 h和16 h达到峰值。pORF5质粒蛋白可增强THP-1细胞NALP3、ASC和Caspase-1 mRNA的表达,促进Caspase-1的活化;NALP3-siRNA、ASC-siRNA及Caspase-1抑制剂处理组IL-1β和IL-18的产生水平均显著低于对照组(P<0.05)。结论:pORF5质粒蛋白通过激活NALP3炎性复合体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18。

GLS3′-非编码区-荧光素酶报告质粒的构建及其活性鉴定

目的构建颗粒溶素基因3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)-荧光素酶报告质粒,检测颗粒溶素和微小RNA(miRNA)调控位点的关联性。方法将人工合成的GLS基因3’-UTR区序列,克隆至荧光素酶报告质粒pGL3-control;通过Targetscan5.1等软件预测可能与GLS基因3’-UTR作用的miRNA;将荧光素酶报告质粒和miRNA真核表达质粒共转染293T细胞,为防止脱靶效应,同时转染anti-mir-inhibitor和anti-mir-control,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果用Targetscan5.1软件、PicTar软件和miRBase数据库预测交叉结果显示,miRNA(mir)-218、mir-514、mir-185、mir-611均与GLS基因3’-UTR存在互补结合位点;构建的miRNA真核表达质粒和荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确;2种质粒共转染293T细胞后,miRNA-218可使荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性降低75%左右(P<0.01);转染anti-mir-inhibitor后,荧光素酶的表达恢复到正常水平。结论成功构建了GLS基因3’-UTR荧光素酶报告质粒,通过检测荧光素酶活性,筛选出和GLS表达相关的miRNA片段即miRNA-218,为探讨miRNA调控GLS表达机制打下实验基础。

鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E真核重组表达质粒的构建及其免疫保护性分析

为构建鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)重组真核表达质粒并检测其免疫保护性,本实验将E.tenella表面抗原基因3-1E(E)与鸡IFN-γ、IL-2基因分别串联在真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核重组表达质粒pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2,同时构建对照质粒pcDNA-E、pcDNA-IFNγ、pcDNA-IL2。经酶切鉴定得到预期大小目的片段,测序结果与预期序列一致。将构建的重组质粒免疫鸡只,经western blot检测表明该重组质粒在鸡体内可以正常表达;对感染鸡只的免疫保护效果显示,pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2组抗球虫指数(ACI)分别为181.04、187.30,具有高效的抗球虫效果,为将其进一步研制成为具有实用价值的抗球虫疫苗奠定了基础。

人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒体外转染人黑色素瘤细胞B16的抗肿瘤效应

目的:将人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒于人黑色素细胞B16转染,检测其对抗肿瘤效应的影响。方法:选用人黑色素瘤细胞株B16,设4个组:A组,转染P1/Fas-Mip3β-pIRES组;B组,转染P1/Fas-pIRES组;C组,转染Mip3β-pIRES组;D组,转染pIRES组。转染方法采用Invitrogen(美国)公司的LipofectamineTM2000脂质体转染的方法(6孔板,8×105孔,2mL体系)。分别流式细胞仪检测细胞凋亡率,进行体外补体介导的细胞杀伤(CDC)实验和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实验,获得细胞活力并进行统计学分析。结果:重组质粒成功转染人黑色素瘤细胞株B16:(1)流式细胞仪检测双表达组组细胞凋亡率87.6%,明显较其他组别高。(2)CDC试验发现最小均值的组合为20g/L组B肽-MIP-pIRES。(3)ADCC试验发现最小均值的组合为40∶1组B肽-MIP-pIRES。结论:人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒能在人黑色素细胞B16转染,诱导肿瘤细胞凋亡,并通过CDC及ADCC效应增强免疫反应。

Lipofectamine^(TM)2000介导pIRES2-DsRed2-Hath1、pIRES2-EGFP-NT3质粒对HEK293T细胞共转染的实验研究

目的检测真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3、pIRES2-DsRed2-Hath1在阳离子脂质体介导下对HEK293T细胞的共转染情况。方法分别提取含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3和含有目的基因Hath1的真核表达质粒载体pIRES2-DsRed2-Hath1,在阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导下将其共转染HEK293T细胞,转染后24h,通过Confocal显微镜观察HEK293T细胞的转染情况和转染效率。结果 pIRES2-EGFP-NT3和pIRES2-DsRed2-Hath1能有效转染并共转染HEK293T细胞,其转染率pIRES2-EGFP-NT3为23.79%(157/660);pIRES2-DsRed2-Hath1为8.03%(53/660);共转染率为3.64%(24/660)。结论 pIRES2-EGFP-NT3和pIRES2-DsRed2-Hath1在阳离子脂质体介导下对HEK293T细胞的共转染成功为NT3和Hath1基因共转染耳蜗的实验奠定基础。

质粒载体pIRES2-FL-IL-3转染对脐血CD34^+干细胞增殖影响的实验研究

目的观察真核共表达质粒载体pIRES2-FL-IL-3转染对脐血干细胞增殖水平的影响。方法利用流式细胞检测技术探讨pIRES2-FL-IL-3(共表达组)转染脐血CD34+干细胞后其增殖水平的变化,Western blot技术检测FL和IL-3蛋白表达。另设空白对照组、pIRES2-IL-3组(IL-3组)和pIRES2-FL组(FL组)。结果共表达组细胞增殖指数I、L-3及FL蛋白活性均显著高于对照组I、L-3组和FL组。结论真核共表达质粒载体pIRES2-FL-IL-3转染脐血干细胞后其细胞增殖指数显著提高,与IL-3及FL蛋白活性增加显著相关。

睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达

从土壤中分离睾酮假单胞菌 ,提取其基因组DNA ,PCR扩增 3α 羟类固醇脱氢酶 (3α hsd)基因 ,将扩增产物用NdeⅠ /BamHⅠ消化 ,切下目的基因片段克隆到质粒 pET 15b中构建重组pET 15b .将重组 pET 15b转化入E .coliDH5α中 ,经酶谱分析和测序 ,鉴定出正确的重组质粒 pET 15b .将重组pET 15b转化入宿主菌E .coliBL2 1(DE3) pLysS中 ,用硫代半乳糖苷 (IPTG)进行诱导表达 .提取细菌总蛋白质进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分析并测定酶活性 .粗提物中酶活性高达 2 4 5× 10 5U/L .利用重组蛋白中的 6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析 ,经一步金属螯合亲和层析纯化后 ,重组蛋白在SDS PAGE上呈现出均一的单一条带 ,回收率达 6 8% .活性和纯度均较高的目的蛋白 3α HSD的获得 。

重组质粒pcDNA3-gtfB在哺乳动物细胞中的表达

目的 :检测含有变形链球菌葡糖基转移酶抗原基因 (gtfB)的重组质粒pcDNA3_gtfB能否在哺乳动物细胞COS_1中正确地转录和表达。方法 :采用脂质体介导法 ,将pcDNA3_gtfB转染哺乳动物细胞COS_1,采用RT_PCR法、免疫组化LSAB法、Western免疫印迹法检测重组质粒的转录水平和表达产物。结果 :pcDNA3_gtfB在转染COS_1细胞后具有转录和翻译活性 ,蛋白质表达产物分子量为 116～ 2 12kD ,且可与兔抗葡糖基转移酶抗体发生特异性结合。结论 :重组质粒pcDNA3_gtfB在哺乳动物细胞中能正确地转录和表达 。