重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的影响

目的观察重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒对大鼠主动脉平滑肌细胞(RSMCs)的抗增殖作用机制。方法应用组织块方法培养RSMCs,应用脂质体转染方法将重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒转染体外培养的RSMCs,利用相差显微镜、MTT比色法观察体外培养的RSMCs增殖情况。结果培养72h后,相差显微镜下观察可见重组质粒组细胞增殖明显减少,MTT检测可见重组质粒组RSMCs的抑制率明显高于对照组。结论重组Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒能够抑制RSMCs增殖。

siRNA沉默STAT3基因对人肝癌细胞的抑制及对相关生长调控基因的调节

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对人肝癌细胞的抑制作用及对相关生长调控基因的调节.方法:构建pSilencer3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒,转染人肝癌细胞株SMMC 7721,采用MTT法观察重组质粒对肝癌细胞的生长抑制,RT-PCR和Western blot及免疫组化法分别观察STAT3基因和蛋白水平的变化,同时检测survivin,c-myc,VEGF,p53,caspase3生长调控基因的mRNA,并用流式细胞技术(FCM)及AO/EB染色方法观察细胞凋亡.结果:pSilencer 3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒对肝癌细胞的生长有抑制作用,实验组48h和72h抑制率分别为59.32%,76.49%,与空白组及阴性组细胞相比有显著性差异(P<0.01);在重组质粒组,STAT3基因mRNA及蛋白水平表达降低,surviving,VEGF的mRNA表达下调,p53,caspase3的mRNA表达上调(P<0.01),c-myc的mRNA表达却无明显改变;重组质粒可诱导SMMC 7721细胞凋亡,凋亡率达21.6%(P<0.01),细胞周期分析显示细胞阻滞于G2期.结论:pSilencer3.0-H1-STAT3-siRNA可能通过下调基因survivin和VEGF mRNA表达,上调p53和caspase3 mRNA表达来抑制STAT3基因在人肝癌细胞中的表达.

质粒介导的RNAi沉默mdr1基因增强白血病耐药细胞HT9对姜黄素的敏感性

通过pSilencer 2.1质粒介导的RNAi技术沉默急性早幼粒白血病耐药HT9细胞的耐药基因mdr1表达,可提高耐药细胞对姜黄素的敏感性。通过设计合成靶向mdr1基因的shRNA干扰片段,定向克隆到pSilencer 2.1-U6neo质粒中,成功构建沉默mdr1基因特异表达的shRNA表达载体,电转染HT9细胞后筛选阳性克隆扩大培养。采用实时荧光定量PCR、Western blot检测细胞mdr1基因表达情况,流式细胞术检测P-糖蛋白外排泵功能,MTT法和流式细胞技术检测细胞对药物敏感性和细胞周期分布。结果显示,构建的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1转染HT9细胞后,HT9/pU6/shRNA细胞mdr1 mRNA表达降低了78.84%(P<0.01),P-糖蛋白的表达量降低了48.27%(P<0.05),细胞内Rho123相对荧光强度由10.8%±0.58%升高至73.56%±1.37%;转染细胞对姜黄素敏感性明显增强,IC50由(24.10±0.83)μmol/L降至(5.10±0.14)μmol/L;耐药相对逆转率为84.74%±1.86%,与HT9细胞相比,经姜黄素处理的稳定转染细胞HT9/pU6/shRNA细胞周期阻滞在S、G2/M期。说明质粒介导的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1能够稳定、持久地抑制mdr1基因表达,能有效增强HT9细胞对姜黄素的敏感性。

抗大肠癌siRNA载体上报告基因的构建与鉴定

目的:在siRNA载体上构建带绿色荧光蛋白(GFP)的报告基因,此重组质粒用于抗大肠癌的进一步研究。方法:用分子克隆技术构建绿色荧光蛋白基因与真核细胞表达载体pSilencer3.1-H1的重组体(pSilencer3.1-H1/GFP),并用脂质体介导的转染技术,将其导入人大肠癌细胞。结果:GFP基因的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可见目的片段大小与预期一致。重组pGEM-GFP克隆插入序列经测序鉴定结果与GenBank报道一致。重组质粒pSilencer3.1-H1/GFP用NruⅠ和PstⅠ双酶切后可见2条电泳带,3500 bp为pSilencer3.1-H1质粒片段,700 bp左右为GFP片段,以PCR分析此插入序列也获得约700 bp的泳带,与预期一致。此重组质粒转染大肠癌细胞后,在倒置荧光显微镜下可见视野内发绿色荧光的细胞。结论:成功构建了含报告基因的重组质粒pSilencer3.1-H1/GFP,此重组质粒可进一步用于抗大肠癌的研究,方便转染效率的直观观察,有利于流式细胞仪的检测。

沉默CC型趋化因子受体5对人乳腺癌细胞黏附及迁移的影响

构建CC型趋化因子受体5(CCR5)基因shRNA的真核表达载体,探讨沉默CCR5对乳腺癌细胞黏附与迁移能力的影响。在多种人乳腺癌细胞中检测CCR5的基因表达,选择CCR5表达较高的MDA-MB-231细胞做为基因沉默的研究对象;设计并合成2对靶向人CCR5基因的RNA沉默序列,连入基因沉默载体pSilencer 2.1-U6中,构建沉默质粒shCCR5-1和shCCR5-2,定量PCR和蛋白印迹法检测CCR5基因沉默的效率;以细胞黏附实验和Transwell趋化小室实验分别检测沉默CCR5对MDA-MB-231细胞黏附和迁移能力的影响。结果表明,沉默CCR5可以抑制MDA-MB-231细胞的黏附能力,同时显著降低MDA-MB-231细胞的迁移和趋化。

MDM2基因敲低对白血病细胞株K562的影响

【目的】研究 MDM2基因对白血病细胞的影响,探讨 MDM2基因在白血病发病机制和治疗方面的意义。【方法】用 pSilencer4.1-CMV neo 构建 MDM2 shRNA 表达载体 pMDM2-shRNA,采用脂质体将载体导入 K562细胞,G418筛选出稳定表达 shRNA 细胞,然后用在流式细胞仪检测细胞周期变化和细胞凋亡率,用多重 RT-PCR 和 Western blot 检测细胞基因表达水平。【结果】转染 pMDM2-shRNA 的细胞 MDM2 mRNA 及蛋白质的表达均下降>70%,细胞增殖减慢,G1-S期阻滞,细胞凋亡增加。伴随 MDM2基因表达下调,多种基因表达出现较明显改变,包括 P21表达增加,E2F1和 P65表达下降。【结论】MDM2基因表达下降后,可导致细胞增殖减慢和细胞凋亡;结果表明 MDM2对多种基因的表达具有调控作用,提示 MDM2有可能成为白血病治疗的新靶点。

内源性siRNA对RAB5A和RABEX5表达的抑制作用

目的研究内源性的siRNA对RAB5A和RABEX5表达的抑制作用。方法利用siRNA表达载体pS ilencerTM2.1U6-neo对RAB5A和RABEX5基因分别构建3个特异的siRNA表达载体,并将表达载体分别转染人卵巢癌高转移细胞HO-8910PM。应用逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹检测转染前后HO-8910PM细胞中RAB5A和RABEX5的表达情况,并用荧光免疫细胞化学技术对干扰效率最好的载体进行验证。结果在构建的6个siRNA表达载体中,pS ilencer/siRAB5A-1和pS ilencer/siRAB5A-2对RAB5A表达的抑制率分别为90%和70%,pS ilencer/siRAB5A-3对RAB5A表达没有抑制作用。pS ilencer/siRABEX5-1、pS ilencer/siRABEX5-2和pS ilencer/siRABEX5-3对RABEX5表达的抑制率分别为30%、50%和90%。结论成功构建了对RAB5A和RABEX5表达具有抑制作用的siRNA表达载体,为进一步研究RAB5A和RABEX5的生物学功能提供了实验工具。

靶向mrp1基因shRNA表达载体构建

目的:构建靶向mrp1基因的shRNA表达载体。方法:根据mrp1基因序列设计并合成编码shRNA的DNA模板,将其定向克隆到psilencer2.1U6-neo质粒上,构建重组载体。经菌落PCR和DNA测序分析检测重组载体构建结果。结果:成功构建靶向mrp1基因shRNA表达载体。结论:为进一步研究mrp1基因在肺癌多药耐药中的作用以及探索肺癌的基因治疗奠定了基础。

pSilence APE1对骨肉瘤诱导血管内皮细胞迁徙抑制作用的实验研究

目的观察APE1siRNA表达载体pSilenceAPE1对骨肉瘤诱导血管内皮细胞迁徙的抑制作用及其与ES的协同作用。方法pSilenceAPE1转染骨肉瘤细胞9901和HOS;骨肉瘤和内皮细胞Transwell双室培养,计数迁移到内室膜背面的内皮细胞数,观察pSilenceAPE1及其联合ES对骨肉瘤细胞诱导内皮细胞迁徙的影响。结果ES低剂量组(350ng/ml)和高剂量组(700ng/ml)与正常对照组有明显差异(P<0·01)。2μgpSilenceAPE1和3μgpSilenceAPE1较单独脂质体组有显著性差异(P<0·01)。2μgpSilenceAPE1和ES低剂量(350ng/ml)联合组抑制内皮细胞迁徙的作用显著高于单独对照组(P<0·01)。结论pSilenceAPE1可显著抑制骨肉瘤细胞诱导的血管内皮细胞迁徙,并且可能与ES具有协同抗血管生成的作用。

siRNA诱发K562/Adr细胞凋亡的机制研究

目的研究siRNA引起K562/Adr细胞凋亡的机制。方法siRNA重组质粒pS ilence MDR-1和pS ilence neo-GSTπ转染K562/Adr细胞,透射电镜观察K562/Adr细胞超微结构变化;W estern b lot检测凋亡相关蛋白Bc l-2的改变。结果透射电镜下,pS ilence MDR-1和pS ilence neo-GSTπ转染组细胞胞浆浓缩、线粒体出现肿胀空泡样变、胞核内染色质浓集、染色质形成新月体样改变并有凋亡小体形成等典型的凋亡改变;W estern b lot结果表明pS ilence MDR-1和pS ilence neo-GSTπ转染组发生凋亡的K562/Adr细胞中,Bc l-2含量明显减少,与mock相比差异具有显著性意义(P<;0.05)。结论siRNA重组质粒pS ilence MDR-1和pS ilence neo-GSTπ通过抑制Bc l-2表达诱导K562/Adr细胞发生凋亡,逆转其多药耐药的发生,从而为siRNA逆转白血病多药耐药提供坚实的理论依据。

MicroRNA-21、PTEN基因真核及shRNA表达载体构建

为了构建microRNA-21、第十号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)真核表达载体pEGFP-N1-pre-miR21、pEGFP-N1-PTEN及短发夹状RNA(shRNA)表达载体Psilencer4.1-CMV-mir21-shRNA、Psilenc-er4.1-CMV-PTEN-shRNA,我们根据microRNA-21、PTEN基因序列设计合成shRNA及PCR引物;将microRNA-21、PTEN shRNA片段退火后的DNA模板定向克隆到Psilencer4.1-CMV质粒;另采用RT-PCR技术从人结肠癌细胞HCT-116中扩增pre-miR-21及PTEN,并将PCR产物双酶切后定向克隆到pEGFP-N1质粒上,构建重组载体。经菌落筛选、双酶切及DNA测序分析检测重组载体构建是否成功。结果显示筛选出的阳性克隆经双酶切鉴定得到与载体及目的片段大小一致的两条片段。测序证实目的基因pre-miR-21、PTEN及其shRNA序列分别正确连接到pEGFP-N1及Psilencer4.1-CMV的多克隆位点。结论:成功构建microRNA-21、PTEN基因真核表达及shR-NA表达载体,为进一步研究microRNA-21及PTEN基因在结直肠癌中的作用奠定了基础。

单核细胞趋化蛋白-1小分子干扰RNA真核表达质粒的构建及意义

目的构建单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,为进一步研究其对动脉粥样硬化(AS)的防治作用提供手段。方法设计并合成两端含有酶切位点两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSi-lencer 2.0-U6中构建重组表达载体,转化DH-5α菌株,提取质粒行双酶切鉴定,并进行序列测定。结果双酶切证实MCP-1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。结论成功构建MCP-siRNA表达载体,为动脉粥样⒉化的防治奠定实验基础。