基于PiggyBac转座系统的低溢漏诱导型Tet-On过表达体系的建立及应用

为避免诱导基因稳定表达的Tet-On诱导表达系统溢漏表达,实现简便且高效的外源基因稳定诱导表达,本研究拟在Tet-On调控的转录水平基础上,将基于稳定配体Shield-1的不稳定结构域FK506结合蛋白引入目的基因的N端,从蛋白水平控制其本底表达水平.为验证该系统的效果,本研究以荧光蛋白TdTomato为报告基因,经流式分析结果证明优化后的体系较原体系的溢漏表达在蛋白水平上降低7倍左右.将该系统应用于基于小鼠胚胎干细胞的体外牙向分化模型,在诱导因子Dox和稳定配体Shield-1的协同作用下,诱导表达牙齿发育相关转录因子Hand2提高了牙向分化诱导的完成度.

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达

以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H。首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-TpepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48。然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应。

蓝藻热休克诱导高效表达系统的构建

以聚球藻Synechococcussp .PCC794 2作为基因工程受体菌 ,构建了热休克诱导的高效表达系统。用PCR法扩增并克隆出Synechococcussp .PCC794 2自身的热休克基因 groESL操纵子的强启动区 (2 4 0bp) ,并紧靠其后组装上泛素 (UB)融合的胸腺素α1(Tα1)目的基因 ,在下游组装有rbcSpolyA终止子。此外 ,还组装了一个完整的卡那霉素抗性基因作为筛选标记基因。这样 ,就构建了完整的蓝藻的基因表达系统。经转化蓝藻Synechococcussp .PCC794 2细胞 ,在 4 2℃热诱导 30min后 ,目的基因UB Tα1得到较高水平表达 ,表达量约占可溶性蛋白的 8.7%

应用荧光定量PCR验证干扰素诱导表达基因在系统性红斑狼疮患者中的表达

目的 应用荧光定量聚合酶链反应技术验证由基因芯片发现的干扰素 (IFN)诱导基因表达谱在系统性红斑狼疮 (SLE)、类风湿关节炎 (RA)和正常人中的表达。方法 测定 4 0例SLE患者、2 8例RA患者和2 9名正常人外周血白细胞Ly6e、IFIT1、OAS2IFNw、IFNa13表达 ,初步分析外周血分离出来的T、B及单核细胞中这些基因的表达。结果 与正常人相比 ,SLE组的Ly6e、IFIT1、OAS2基因表达显著增高 ,其中Ly6e、OAS2基因的表达较RA组也显著增高 ,但IFNw、IFNa13基因表达反而降低 .这组基因在单核细胞的表达最高。结论 IFN诱导的基因在SLE患者中呈高表达 。

可诱导的shRNAs表达系统对HeLa细胞SMYD3基因表达的抑制

目的:探讨可诱导的shRNAs表达载体介导的RNA干扰技术对HeLa细胞SMYD3基因的抑制作用。方法:设计和构建由强力霉素调控产生针对SMYD3基因的shRNAs表达质粒,转染至HeLa细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,RT-PCR检测SMYD3基因的表达,MTT法检测对细胞增殖的影响。结果:酶切鉴定、测序分析证实shRNAs表达质粒构建成功。转染HeLa细胞后,在强力霉素诱导下,受到特异SMYD3 shRNAs干扰的HeLa细胞发生了典型的凋亡形态学改变。同时SMYD3 mRNA表达下调,细胞生长受抑制。而阴性对照组和空白对照组无明显变化。结论:针对SMYD3基因的可诱导的shRNAs表达质粒转染HeLa细胞后,在强力霉素的作用下,可阻断SMYD3基因的表达,抑制HeLa细胞的增殖,并能诱导HeLa细胞凋亡。

单质粒模式诱导表达载体系统的建立

在Invitrogen公司T Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导 2 4h后目的基因的表达水平提高了 8 9倍。

交通诱导系统中道路网络的表达与存储方法

考虑实际道路网络的特殊性以及最短路径算法对路网信息的要求,运用对偶图法的基本思想对前向关联边结构进行了改进,提出了一种能够提高路径优化算法实时性的路网表达方法与数据存储结构,并用Dijkstra和A*最短路径算法进行了验证。结果表明,这种方法在清楚表达转向限制、消除结点权重的同时,由于两个指针数组的引入,使得算法可以迅速而准确地定位相关结点的位置,从而减小了搜索空间,降低了最短路径算法的时间复杂度,提高了最短路径的搜索效率。

用四环素诱导调控表达系统构建弓形虫脂肪酸合成酶FABZ缺陷株

目的构建基于四环素诱导调控表达系统的刚地弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)缺陷株。方法从弓形虫基因组中扩增fabz基因并构建四环素调控诱导表达载体pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR,电穿孔法导入弓形虫TATi株,通过乙胺嘧啶抗性和极限稀释法筛选FABZ缺陷株,蛋白质印迹(Western blotting)检测虫体内附加表位标签Ty的表达。在5×105个FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素(终浓度为1μg/ml),Western blotting检测带有Ty标签的FABZ表达情况。结果筛选获得的缺陷株可表达带有Ty标签的转运肽型FABZ和成熟型FABZ。FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素24 h和48 h后,转运肽型FABZ表达量均较对照组显著降低(P<0.05)。结论构建了由脱水四环素调控表达的弓形虫FABZ缺陷株。

食品级高效诱导表达系统—NICE系统

乳酸菌NICE系统是在乳链菌肽诱导下由nisA启动子控制目的基因表达的,含nisR和nisK的两组分调节系统的高效诱导表达系统。由于NICE系统的诱导剂、宿主菌和载体都是食品级的,其应用前景十分广阔。

植物的化学诱导表达系统

利用植物内源性化学诱导启动子或其它生物的化学诱导响应元件都可以在植物中构建化学诱导表达系统。化学诱导表达系统可以分为去抑制、失活、激活三种 ,三种方式的原理相似 ,需要两个转录单位组成 ,第一个转录单位由一个组成型启动子 (如CaMV 35S)转录一个对化学诱导剂敏感的转录因子 ,第二个转录单位含有多个能结合转录因子的位点与一个基本植物启动子 (如截短的CaMV 35S)组成的嵌合型启动子调控目的基因的表达。构建双元调控系统可以克服单元系统的不足。文章叙述了一些已构建的化学诱导系统的特征和局限性 ,阐明了理想化学诱导表达系统的要求和理想化学诱导剂的条件。指出化学诱导系统的应用是很有前途的。

Retro-Tet:一种基于逆转录病毒的诱导性基因表达系统

Retro Tet基因表达系统是一种新型的高效、稳定、无毒、具有严密开 关功能的可诱导性真核细胞基因表达系统 .该系统兼备了逆转录病毒基因表达系统和Tet off Tet on基因表达系统的优点 ,在稳定表达细胞系的筛选、基因的表达与调控及基因功能研究等方面得到了成功的应用 。

化学诱导表达系统及其在植物中的应用

化学诱导启动子可以在特定时间和部位激活或抑制目的基因的表达。目前,已经建立了多种化学诱导表达系统,用于基因功能分析、无标记植物转化、特定位点DNA切除、育性恢复和RNA沉默等方面的研究。化学诱导表达系统为基础分子生物学研究和生物技术应用提供了强有力的工具,将大大加快植物转基因技术的应用。

植物基因的化学诱导表达系统研究进展

激活基因表达或使基因表达失活的化学诱导系统在确定基因功能及植物生物技术中有许多潜在的应用。基因表达的精确调控是化学诱导系统的重要方面。综述了植物基因的化学诱导表达系统的种类以及最新应用,并对其发展趋势进行了展望。

枯草杆菌诱导型高效表达-分泌系统的构建

利用枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株,sac B诱导基因及degQ,degU(Hy)正调控基因构建了诱导型表达-分泌系统以解决枯草杆菌分泌大量胞外蛋白酶和外源基因表达水平不高的问题,采用共转化方法将枯草杆菌IA95的degU(Hy)突变引入枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株DB403,获得degU(Hy)和蛋白酶三缺陷的新菌株DB1342;利用sacB基因的启动子——信号序列及芽孢杆菌的两个正调控基因degQ和degU(Hy)构建了诱导型表达-分泌载体pURT3及pURTQ4,由DB1342突变株及pURT3及pURTQ4载体组成枯草杆菌诱导型高效表达和分泌系统.在本系统中内源基因sacB的表达量是原菌株DB403的296倍,将地衣杆菌α-淀粉酶基因引入本系统后在sacB,degQ.degU的调控和蔗糖的诱导下,α-淀粉酶的表达量是在DB403中的140倍,证实degQ及degU对基因表达的增强作用是叠加的.

可用于转基因动物的基因诱导表达系统

可诱导的基因表达系统对于研究基因的功能活动及其产物的生物学功能很有意义。它在转基因动物中的应用已经十分成功。本文介绍了最近出现的ＩＮＦ－ Ｍｘ１ 诱导表达系统、Ｔｅｔｏ 诱导表达系统、Ｅ－ ＥＣＲ 诱导表达系统和ＲＵ４８６ 诱导表达系统的基本原理及其应用情况，并对其优缺点进行了分析和评价。

鸣禽前脑听觉和鸣唱系统zenk基因的诱导表达

鸣曲和鸣唱行为可以诱导鸣禽前脑不同区域的zenk基因表达.鸣禽听到同类鸣曲时在听觉系统会出现zenk表达,并在致聋后这种诱导消失.而鸣禽鸣唱时,在鸣唱系统同样有zenk基因的表达,且不依赖于听觉反馈,因为致聋鸟只要发声就可以诱导表达.大量的研究表明,zenk基因在听区的诱导表达不仅可对同类鸣曲进行识别,而且在教习曲模板的记忆方面发挥重要作用.鸣唱系统zenk基因诱导表达则主要与鸣曲的产生与维持有关.zenk基因在两个系统中的诱导表达将听觉感知与鸣唱运动紧密联系起来.

植物基因工程中化学诱导表达系统研究近况

利用可诱导表达系统可使目的基因在特定的时间内表达 ,从而有利于我们研究其基因产物的作用。本文着重介绍了几种利用植物远缘物种的调控元件构建而成的化学诱导系统 。

小鼠H1foo基因四环素诱导表达系统的构建与表达

卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研究H1foo的功能,本试验通过采用四环素诱导表达载体系统,用PCR的方法扩增了小鼠的H1foo基因和四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子区。用双酶切和连接等方法将上述元件连接到真核表达载体pVenus上,构建了重组质粒pVenus-tet-CMV-H1foo。双酶切和测序结果显示,片段连接正确,且全长测序正确。本试验所构建的四环素诱导的小鼠H1foo真核表达系统有助于人们在体细胞中更好地探讨H1foo在特定时间的作用和功能。

化学诱导表达系统在植物基因工程中的应用

化学诱导型启动子能够从时空上精确调控基因的表达,是研究基因产物的有力工具。利用植物内源性化学诱导启动子或其他生物的化学诱导响应元件都可以在植物中构建化学诱导表达系统。文章介绍了化学诱导表达系统的类型及其构建原理,并对其在植物基因工程中的应用提出了展望。