pUC衍生质粒的一个低拷贝数突变型

本文报道大肠杆菌的ColE1类似质粒的一个低拷贝数突变型。从载体质粒pUC4衍生的重组质粒pPGVT3在大肠杆菌宿主DF2145中是不稳定的,以pPGVT3转化DF2145时在4o℃培养得不到转化子。用诱发点突变的羟胺体外处理pPGVF3质粒DNA,得到一个稳定性提高了的突变质粒pPGVT3HA,突变的位置被确定在质粒的pUC部分,突变降低了pUC及其衍生质粒的拷贝数。文中对质粒的稳定性与拷贝数的关系作了讨论。

基于低拷贝质粒的高产紫色杆菌素谷氨酸棒杆菌的构建和发酵

该研究以公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为宿主,构建高产紫色杆菌素的重组菌株。利用谷氨酸棒杆菌天然大质粒pTET3的复制与分配元件,构建了低拷贝质粒pOK12CG1,该质粒在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数约为6拷贝/基因组,且与谷氨酸棒杆菌常用质粒pEC-XK99E和pXMJ19兼容。以低拷贝质粒pOK12CG1为骨架构建了携带紫色杆菌素合成操纵子(vioABCDE)的质粒pCGvio,并分别以谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032和插入序列(Insertion Sequence,IS)元件删除株为宿主,构建了7株合成紫色杆菌素的重组菌株。通过初步筛选,发现基于低拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pCGvio,其紫色杆菌素产量(508.24 mg/L)高于基于中高拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pECvio(376.16 mg/L),而基于低拷贝质粒的IS元件删除重组菌株ISDM023/pCGvio紫色杆菌素产量达到了610.13 mg/L。进一步采用正交实验设计对重组菌株ISDM023/pCGvio进行培养基体积比(V_(LB):V_(BHIS))、诱导时间和IPTG诱导剂浓度这3个因素的发酵条件优化。结果表明,在VLB:VBHIS为1:2、诱导时间为18 h、IPTG浓度为0.75 mmol/L的优化条件下,紫色杆菌素的摇瓶发酵产量可达了1007.47 mg/L。该研究成功构建了紫色杆菌素的谷氨酸棒状杆菌重组菌株ISDM023/pCGvio,为谷氨酸棒状杆菌高效合成紫色杆菌素奠定了实验基础,也为其它产物的高效合成提供参考。

苏云金芽孢杆菌大型质粒DNA的小量提取

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种、猝倒亚种及以色列亚种为材料,介绍了低拷贝大型质粒DNA的小量提取方法,该法采用PEG6000进行质粒纯化,省略了苯酚和氯仿抽提过程。实验证明,该法结果稳定,提取的质粒DNA产量和质量均符合大多数分子生物学实验的要求。