电离辐射质粒pUC18 DNA结构变化的傅里叶变换拉曼光谱分析

采用傅里叶变换拉曼光谱研究了质粒 pUC18DNA经过γ射线电离辐射以后结构的变化。其脱氧核糖 磷酸主链中各振动模式产生的谱带强度有所增加 ,包括 884cm-1处的脱氧核糖 磷酸主链振动谱带、146 0cm-1处的 CH2 弯曲振动谱带和 2 939cm-1处的C—H伸缩振动谱带。碱基杂环弯曲振动谱带 187cm-1位移到 2 0 8cm-1处 ,强度明显减弱。在 32 98cm-1处出现了一个源于N—H伸缩振动的新谱带。此结果表明碱基受损 ,主链断裂 ,超螺旋结构部分解旋。

pUC衍生质粒的一个低拷贝数突变型

本文报道大肠杆菌的ColE1类似质粒的一个低拷贝数突变型。从载体质粒pUC4衍生的重组质粒pPGVT3在大肠杆菌宿主DF2145中是不稳定的,以pPGVT3转化DF2145时在4o℃培养得不到转化子。用诱发点突变的羟胺体外处理pPGVF3质粒DNA,得到一个稳定性提高了的突变质粒pPGVT3HA,突变的位置被确定在质粒的pUC部分,突变降低了pUC及其衍生质粒的拷贝数。文中对质粒的稳定性与拷贝数的关系作了讨论。

质粒pUC18DNA的傅立叶变换拉曼光谱研究

用傅立叶变换拉曼光谱研究了质粒 pUC18DNA的结构。其脱氧核糖 -磷酸主链中各振动模式产生的谱带强度相对较强 ,包括 884cm-1处的脱氧核糖 -磷酸主链振动谱带、145 9cm-1处的 -CH2 弯曲振动谱带和 2 939cm-1处的C -H伸缩振动谱带等 。

原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN的构建及鉴定

目的:合成基因CTP及PTEN基因,构建其原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN,为后续研究其功能做准备。方法:合成基因CTP-PTEN,将该基因定向克隆到原核表达载体pUC57中,构建pUC57-CTP-PTEN重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒进行双酶切、测序鉴定后,用Western blotting检验表达。结果:测序鉴定CTP-PTEN基因合成成功。经双酶切、测序鉴定证实重组质粒pUC57-CTP-PTEN成功转入DH5α,Western blotting检验pUC57-CTP-PTEN成功表达。结论:成功构建了重组质粒pUC57-CTP-PTEN,并在大肠杆菌DH5α中成功表达。

稀土元素La(Ⅲ)对质粒pUC18复制速度的影响

稀土应用的日益增长将会对生物的遗传产生深远的影响 .生物的遗传离不开DNA的复制 ,由于染色体DNA非常巨大和复杂 ,难以直接研究稀土离子对其复制的影响 .以细菌染色体之外的遗传因子———质粒为对象 ,研究La3+对质粒DNA复制速度的影响 .结果表明 :在不同浓度La3+存在下 ,质粒在宿主细胞中复制的速度不同 ;由于质粒复制与染色体DNA复制使用相同的酶系 。

微滴数字PCR检测含有目的基因的PUC57质粒问题分析

目的探讨微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)检测含有目的基因的PUC57质粒过程中出现的问题及解决方法。方法用ECORⅠ酶37℃孵育含有目的基因的PUC57质粒2h和4h,然后65℃孵育20min,灭活ECORⅠ酶。用伯乐QX200TM微滴式数字PCR分别检测PUC57质粒和经ECORⅠ酶酶切后的PUC57质粒,同时对酶切后的PUC57质粒分多天进行检测,对检测结果进行比较。结果含有目的基因的PUC57质粒经ECORⅠ酶酶切2h和4h后的检测值与质粒理论值之间差异无统计学意义(t=-0.192、-0.403,P>0.05),同时酶切与没有酶切的PUC57质粒检测值之间差异有统计学意义(Z=-4.194,P<0.05)。酶切后的检测值与PUC57质粒理论值相符合。酶切后的PUC57质粒随着放置时间的延长,检测值逐渐降低。结论用伯乐QX200^(TM)微滴式数字PCR检测含有目的基因的PUC57质粒时要先酶切再检测,酶切时间只需2h即可将质粒酶切完全,同时酶切的PUC57质粒要尽快检测。

多药耐药草绿色链球菌LuxS基因同源重组质粒的构建

目的:构建一个含有红霉素抗性基因和多药耐药草绿色链球菌LuxS基因上下游区同源序列的重组质粒,为后续进行LuxS基因敲除实验做准备。方法:设计合成引物,分别以质粒PMG36E、草绿色链球菌DNA为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增得到红霉素抗性基因DNA片断和LuxS基因上下游序列,经双酶切反应插入pUC19质粒的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,氨苄青霉和红霉素培养基筛选。结果:红霉素抗性基因和LuxS基因两侧同源序列成功连入到Puc19质粒相应酶切位点,PCR凝胶电泳、测序结果正确。结论:成功构建多药耐药草绿色链球菌LuxS基因敲除同源重组质粒,为进一步构建LuxS突变株打下基础。

微绿球藻DNA质粒文库的构建

微绿球藻（Nannochloropsis oculata）DNA被提取纯化并经超声波处理后，将所得大小在1．6～3kb之间的DNA片段用T4DNA聚合酶补平，再与Sma I酶切消化并经去磷酸化处理的质粒栽体pUCl8连接。转化至DH10B大肠杆菌（Escherichiacoli）的感受态细胞中。建立的DNA质粒文库容量含2×10^4个克隆，其中重组子占90％。随机挑选白色菌落并培养，抽提的质粒经XbaI和SacI双酶切鉴定，显示重组的质粒中均含有大小不等的DNA插入片段。

LMP-1与LMP-3真核双表达质粒的构建及体外表达

目的:构建真核双表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3,并检测其在体外的表达。方法:采用人工设计合成人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)和LIM矿化蛋白-3(LIM mineralization protein-3,LMP-3)基因片段,分别连接于中介质粒Puc57,经酶切、测序鉴定后,LMP-1和pBudCE4.1先连接,经酶切鉴定,再连接LMP-3,重组双表达质粒行酶切、测序鉴定。用脂质体包裹转染骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染LMP-1基因组(C组)、转染LMP-3基因组(D组)、转染LMP-1和LMP-3双基因组(E组)。采用RT-PCR和Western blot检测LMP-1和LMP-3的表达。结果:酶切及测序证实质粒Puc57-LMP-1、Puc57-LMP-3及其pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3真核双表达质粒构建成功。该双表达质粒在体外转染骨髓MSCs后可表达LMP-1和LMP-3分子。对RT-PCR及Western blot检测结果行灰度值测量显示:LMP-1 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),C组与E组差异无统计学意义(P>0.05);LMP-3 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.001),D组与E组差异有统计学意义(P<0.05),C组及D组在LMP-1及LMP-3的表达上的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建真核双表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3,证实转染的骨髓MSCs能在体外同时表达LMP-1和-LMP-3分子。

活体内细菌移位示踪方法的研究

目的为解决内源性感染细菌体内示踪问题，本实验采用ＰＵＣ１９质粒载体示踪加限制性内切酶酶切图谱分析法和荧光标记示踪法，对肠道移位细菌进行了动态观察。并对两种方法进行了比较。方法依据ＰＵＣ１９质粒特点设计了动物模型，１１０只Ｗｉｓａｒ大鼠致成３０％体表面积Ⅲ°烫伤，于６、１２、２４、４８ｈ和１２天分别活杀，做荧光显微镜检查和细菌培养，质粒提取和酶切。结果烧伤后肠道细菌可移位至淋巴结和肝脏，荧光标记方法细菌到达淋巴结（９５％）和肝脏（５７．５％）的百分率略高于ＰＵＣ１９示踪方法（７８．４％、５２．４％）。结论用ＰＵＣ１９质粒载体做示踪物可减少非特异性因素。

溴代色胺酮铁(Ⅱ)配合物的合成、晶体结构及与DNA的作用研究

以天然的生物碱色胺酮(Try)为起始原料,合成了卤代衍生物8-溴色胺酮和其铁配合物[Fe(8-Br-Try)4](1)。X单晶衍射分析表明,配合物1是由中心铁(Ⅱ)原子与两个8-溴色胺酮配体三齿螯合配位,形成一个六配位的变型八面体几何构型。采用紫外吸收光谱和荧光光谱等分析方法研究了配合物1与G-四链体HTG21DNA的相互作用,发现这个化合物与DNA的结合能力较强,它与DNA的紫外结合常数为8.70×10~6 dm^3·mol^(-1)。琼脂糖凝胶电泳实验进一步表明,配合物1能对pUC19质粒DNA产生切割作用。

不吸水链霉菌梧州新亚种基因文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组经Sau3AI不完全酶切,回收3～9 kb DNA酶切片段,用T4连接酶将回收片段按一定比例与经BamHI酶切、南极热敏磷酸酶去磷酸化处理后的pUC18质粒载体连接,热激法转化受体菌E.coliDH5α,在含有IPTG/X-gal和Amp＋的LB平板上筛选重组子,所得克隆数为9×10^3个,以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7 Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99%的基因组,达到了建库要求的理论值。随机挑取白色菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建,为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。

RT-PCR扩增A组轮状病毒VP7片段及其扩增产物的克隆

选用与Ａ组人类轮状病毒（ｈｕｍａｎｒｏｔａｖｉｎｅｓｖｉｒｕｓ，ＨＲＶ）编码ＶＰ７两端的保守序列互补的引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术得到其全长ｃＤＮＡ，用平端连接克隆法将该片段连接于ｐｕｃ１９质粒中，然后转染ＪＭ１０３大肠杆菌，为进一步研究轮状病毒的变异、重组、毒力。

一种简单有效的平端PCR产物克隆方法

介绍一种使用ｐＵＣ质粒做为载体进行平端ＰＣＲ产物连接的方法。首先将特异的ＰＣＲ扩增产物纯化，不经任何处理，与用ＳｍａⅠ内切酶消化的载体ｐＵＣ质粒进行连接，并在连接体系中加入ＳｍａⅠ内切酶，２３℃连接１８～２０小时。转化宿主菌后，挑选白色菌落进行重组鉴定。在ＰＣＲ产物＜５００ｂｐ的ＤＮＡ片段重组阳性率占转化菌白色菌落的７０％，而＞１０００ｂｐ的ＤＮＡ片段重组阳性率占转化白色菌落的１０～２０％。

大肠杆菌DH12S菌株高效电击转化条件的探讨(英文)

探讨了电击转化法介导质粒DNA转化到大肠杆菌DH12S的最佳条件,以提高其转化效率.将pUC19质粒转化大肠杆菌DH12S菌株,观察不同的电击转化条件对转化效率的影响.结果表明,电击缓冲液的离子强度、细菌生长状态、感受态细胞保存时间及质粒DNA浓度对转化效率均有不同程度的影响;在电压2.5 kV,电阻200Ω,电容25μF,脉冲时间4.3ms和低离子强度电击缓冲液的条件下能获得较高的电击转化率,证明该优化电击转化条件能提高转化效率.

高渗漏型AspAT基因工程菌诱导表达的研究

利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导有高渗漏表达现象的天冬氨酸转氨酶(AspAT)工程菌,研究是否可以在这一类基因工程菌中提高酶的产量及活性。在观察IPTG诱导后菌体生长的同时,观察不同的时间及条件下酶活性的变化,发现插入含有天冬氨酸转氨酶基因(AspC,1.2kb)的pUC18质粒的BL21(DE3)在较高渗漏表达的情况下,用IPTG 37℃诱导培养8 h后酶表达开始升高,12 h后趋于稳定表达;同时发现用0.1 mmol/L IPTG诱导后酶的活性提高最多,比未诱导前提高一倍以上。研究认为如果培养条件恰当这类菌应该可以用IPTG诱导高效表达目的酶蛋白。

ArF准分子激光作用超螺旋PUC18 DNA的AFM研究

激光对DNA作用的机理研究,国内外尚无定论,有待进一步深入.龚立三等用YGA四倍频激光（265nm,30ps,50mJ）和准分子激光（KrF的248nm,Laser Roman的512nm）处理λ-DNA和λ-DNA/HindⅢ,用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测,增色效应和拖尾的出现表明DNA的结构键被激光脉冲切断.作者用YAGQ开关二倍频激光（532nm,1.5mJ,20ns）照射λ-DNA/HindⅢ、鱼精 DNA、小牛胸腺DNA和酵母RNA,测定了DNA的UV谱,并讨论了激光辐照导致DNA链断裂的分子机制.到目前为止,尚没见到采用扫描隧道显微镜（STM）和原子力显微镜（AFM）为手段研究激光对DNA作用机理的报道. 我们在文献中报道了AFM观察CO2激光作用后的质粒DNA和小牛胸腺DNA样品的结果.本文中用ArF准分子激光（193nm,单脉冲能量为220mJ,20ns）作用超螺旋PUC18 DNA,并用AFM获得了它们的结构图象,讨论了激光和DNA的可能作用机理.

pNZ8149-IL21基因乳酸菌表达载体的构建与表达特性

构建重组质粒pNZ8149-IL21,并将其转到乳酸球菌中,利用Nisin诱导基因表达系统分析重组质粒在乳酸球菌中的表达。采用基于聚合酶链式反应的精确合成(PCR-based accurate synthesis,PAS)的方法,合成目的基因IL21,连入载体pUC57,获得重组质粒pUC57-IL21;对含有目的基因的pUC57-IL21和pNZ8149质粒进行双酶切后,构建pNZ8149-IL21质粒;采用电转化方法将连接产物转化进NZ3900,涂板挑取12个单菌落培养后,进行PCR验证,筛选出阳性克隆,从诱导剂Nisin的浓度(30,50和100 ng/m L)和诱导时间(12和24 h)进行诱导条件优化分析IL21在乳酸菌中表达。目的蛋白在乳酸菌NZ3900中得到表达,在50 ng/m L的Nisin诱导24 h可见目的蛋白在相对分子质量15 k左右有条带表达,Nisin诱导24 h的效果优于12 h。结果说明选择乳酸菌作为载体表达系统,构建IL21高表达的重组乳酸菌是可行的。