离子交换高效液相色谱法分析质粒pUDKH

采用阴离子交换高效液相色谱法监测重组质粒pUDKH的生产过程和该质粒产物中超螺旋pUDKH的比例。所用的色谱条件为:色谱柱TSKgelDNA NPR(4 6mmi d ×75mm);流动相体系由20mmol/LTris HCl(pH8 8)和1mol/LNaCl组成,梯度洗脱方式。分析结果表明:质粒产物中超螺旋pUDKH含量达95%(质量分数)以上时,检测不到残留的核糖核酸(RNA)。高效液相色谱法检测质粒pUDKH产物及其生产过程的灵敏度高、试样用量少,分辨率高。

局部pUDKH基因治疗对实验性犬缺血肢体的某些生理、生化变化的影响

目的探讨携带人肝细胞生长因子基因的真核表达质粒pUDKH在治疗犬肢体缺血时对其生理、生化的影响。方法建立犬左下肢血管完全闭塞性血管病模型,一次性局部肌肉注射不同剂量pUDKH,并在不同时间点检测犬生理、生化指标。结果转染pUDKH组,能使损伤的血管功能恢复,股动脉血流量恢复,脉搏搏动有力,下肢活动正常,肌电图指标无明显改变。血液生化指标在正常值范围内波动。结论局部pUDKH基因治疗犬肢体缺血后对其生理、生化无明显影响。

pUDKH基因治疗犬下肢缺血后对血管、肌肉组织的影响

目的：观察pUDKH（携带肝细胞生长因子基因的质粒）基因治疗犬下肢缺血后对其血管和肌肉组织病理学的影响．方法：杂种犬在静脉内注射苯巴比妥钠麻醉下，于左后侧腹股沟在股动脉由髂外动脉分支处的起始端进行全结扎，造成肢体缺血模型．模型犬被随机分为对照组和pUDKH处理组，并在结扎后即刻分别注射pUDK（空白质粒）或pUD—KH．于手术后3mo，行左髂外动脉造影术，测定股动脉血流量和下肢远端局部温度，并从被结扎的后肢股动脉及内外侧肌肉取组织标本，经常规组织病理切片染色，光学显微镜下观察．结果：3mo时血管造影pUDKH组可见明显血管网的形成，而转移空质粒的对照组仅见少量新生血管；此时转移pUDKH组犬股动脉血流量已恢复到结扎前的水平，而对照组股动脉血流量仅为结扎前的1／5～1／3；转移pUDKH组结扎侧肌肉温度与健侧相比无明显差异，而对照组两肢体肌肉温度却相差1～2℃．组织学观察对照犬可见结扎点远端股动脉塌陷，肌束间动脉管壁变厚，管腔变小甚至消失，少见新生的小血管；pUDKH处理组犬结扎点远端股动脉管腔开放，肌束间小动脉壁均普遍未见增厚，管腔亦未缩小；对照犬结扎侧肌纤维变性、断裂、肌束内水肿、脂肪性变，pUDKH处理组结扎侧的肌肉组织中上述病变不明显．结论：pUDKH的局部注射对犬下肢缺血后血管和肌肉具有保护作用．

重组质粒pUDKH的质量分析

目的:分析研究pUDKH的质量。pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。方法:用光密度法分析pUDKH的浓度及纯度;用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋pUDKH比例及RNA;以地高辛标记的核酸探针固相斑点杂交法测定残留宿主DNA含量;用酶联免疫法测定残留宿主菌蛋白;以4组限制性内切酶分析一致性;PCR扩增目的基因片段;抑菌圈测定板测定残余抗生素;用鲎试剂检测细菌内毒素;对CHO细胞进行基因转染;ELISA检测上清HGF表达量;用Transwells法分析表达的上清液诱导ECV304细胞迁移数。结果:03批次pUDKH的浓度为1.97mg/mL,D260nm/D280nm值为1.84,超螺旋pUDKH比例为95.5%;电泳图谱中未见RNA;残留宿主DNA含量低于质粒DNA的0.2%;菌体蛋白质残留含量低于质粒DNA的0.1%;限制性酶切图谱与自行制备的对照品一致;PCR扩增到HGF基因片段,长约2.2kb;未见残余抗生素(卡那霉素)抑菌圈;细菌内毒素≤0.03125EU/mL;转染的CHO细胞上清HGF表达量为39.32ng/mL;表达的上清诱导ECV304细胞迁移数高于对照组2倍。结论:03批次pUDKH的质量符合药学规格。

犬下肢缺血后pUDKH基因治疗对股神经的保护作用

目的:观察pUDKH基因治疗犬下肢缺血后对其神经组织病理学的影响。方法:杂种犬静脉注射戊巴比妥钠麻醉后,结扎左侧股动脉起始部,建立下肢缺血模型。股动脉结扎后即刻,大腿肌肉局部注射pUDK(对照组)或不同剂量pUDKH(pUDKH处理组,0.15、0.3、0.6 mg/kg)。术后3个月,取股神经及其周围肌肉组织行病理学检查。结果:对照组股神经及其细小分支均发生显著的退行变,累及轴突、髓鞘和施旺氏细胞核,而经pUDKH处理组各级神经病变不明显,有的甚至与正常犬无差别。结论:pUDKH的局部注射可减轻或阻遏犬下肢缺血后股神经的组织损伤,具有一定的神经组织保护作用。

重组质粒pUDKH工程菌库的制备及检定

目的:pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。为了生产制备重组质粒pUDKH,须建立菌种库并对其进行质量检定。方法:将质粒pUDKH转化大肠杆菌DH5α,经筛选后制备成初始菌种库和工作菌种库,对菌种进行革兰染色、电镜、抗生素抗性、遗传稳定性、质粒拷贝数、生化反应等检定。结果与结论:菌种生产pUDKH的产量较高,无支原体及其他微生物污染,40代次内菌种性状、遗传稳定性、质粒拷贝数均稳定,可作为工艺生产用菌种。

高效液相色谱法测定质粒pUDKH中曲拉通X-100的含量

目的检测质粒pUDKH最终产品中去污剂曲拉通X 10 0 (TritonX 10 0 )的残留含量。方法用高效液相色谱法测定TritonX 10 0残留含量 ,色谱柱为C18柱 ,流动相为乙腈 水 (70∶30 ) ,流速为 1.0ml/min ,进样量 10 μl,检测波长 2 2 3nm。结果平均回收率为 10 0 .19% ,日内精密度为 4 .36 % ,日间精密度为 4 .17% ,TritonX 10 0在 1.2 5～2 0 μg/ml浓度范围内呈线性关系。pUDKH产品中的TritonX 10 0含量在 2 .2 7～ 3.0 0 μg/ml之间。TritonX 10 0的最低检测限可达 1.0 μg/ml。 结论此法有良好的准确度与精密度 ,供试品不需预处理 ,不受其它成分的干扰。

质粒pUDKH基因治疗大鼠肢体动脉闭塞病的实验研究

目的 研究携带人肝细胞生长因子 (HGF)基因的质粒pUDKH对大鼠肢体动脉闭塞病的治疗效果及最低有效剂量。方法 手术结扎大鼠左侧后肢股动脉 ,造成急性缺血性血管病模型。并随机分为 5组 ,每组 10只 ,在手术后即刻将 pUDKH以 5 0 μg、10 0 μg、2 0 0 μg、4 0 0 μg、0 μg剂量一次多点注射于结扎部位肌肉内 ,并于注射后第 10天 ,评价各组血管新生及肌肉组织的情况。另 12只大鼠手术后即刻局部多点注射 2 0 0 μgpUDKH( 6只 )或pUDK( 6只 ) ,注射后不同时间点 (第 3,5 ,10 ,14 ,2 1天 )检测骨骼肌组织中HGF的表达。结果 于转移pUDKH质粒后第 3、5、10、14天肌肉标本与对照组比较均可见较强的HGF的表达。第 10天观察到pUDKH组 (除 5 0 μg组外 ) ,在肌肉组织间或软组织中有丰富的小血管形成。半定量评价各组血管再生程度 ,pUDKH 10 0 μg组 ( 0 96± 0 0 7)、2 0 0 μg组 ( 1 97± 0 91)、4 0 0 μg组 ( 2 2 6± 1 0 0 )与对照组 ( 0 2 7± 0 0 4 )之间差异有显著意义 (P <0 0 5 )。结论 人肝细胞生长因子基因治疗大鼠肢体动脉闭塞病是有效的 ,且以 10 0 μg组为最低有效剂量。

pUDKH基因治疗制剂临床前安全性初步分析

目的:观察大鼠肌肉注射pUDKH后,出现毒性反应的时间、性质和程度,为临床毒副反应的监测和确定初始安全剂量提供依据。方法:实验设3个组,即正常对照组、pUDKH小剂量(0.63 mg/kg)和大剂量(2.50 mg/kg)组,给药途径为肌肉注射,且每只大鼠的给药方式相同,每只大鼠共给药14次,停药后观察16周。试验期间观测一般药物反应,分析尿液生化和血清生化,测定大鼠血清中抗人肝细胞生长因子(HGF)的抗体,目的基因HGF在多种组织内的分布,病理组织学检查各脏器的组织结构。结果:试验中给药组动物未见药物毒性反应,尿生化指标基本无有意义的变化,各时间点血清生化也无明显有意义的改变。各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体。除了注射局部的肌肉组织检测到高表达的HGF外,其他组织未见到高表达的HGF。各脏器病理学检查均未见异常改变。结论:大鼠肌注pUDKH剂量为0.63 mg/kg和2.5 mg/kg两种,分别是大鼠起始有效剂量的3倍和12.5倍,各项观测指标未见明显有意义的改变,故在本试验条件下可视2.50 mg/kg以下为安全剂量,pUDKH基因治疗大鼠肢体缺血是安全、可行的。

股动脉周围骨骼肌多点注射携带肝细胞生长因子基因重组质粒糖尿病大鼠肢体缺血骨骼肌的组织学变化

背景:质粒载体因其较好的生物安全性和较高的体内维持时间,被广泛应用于基因治疗研究领域。目的:观察携带肝细胞生长因子基因重组质粒pUDKH在糖尿病后肢缺血模型大鼠股动脉周围骨骼肌多点注射15d后骨骼肌组织的病理学变化。方法:利用STZ制备SD大鼠糖尿病模型。随机分为3组,建模后24h内高浓度组注射pUDKH 200μg/只,低浓度组注射pUDKH 100μg/只,对照组注射等体积医用注射用水。15d后,取大鼠的骨骼肌组织进行病理学观察。结果与结论:对照组肌浆萎缩变性,纤维化增生并透明变性,浆细胞浸润变性,肌间隙变宽,有局灶性脓肿形成;pUDKH治疗后有丰富的微血管形成,高浓度组肌纤维横纹较低浓度组保持完整。提示携载肝细胞生长因子基因质粒pUDKH对糖尿病大鼠肢端缺血有治疗作用。