甲型副伤寒杆菌pagC基因分布及其重组表达产物免疫保护作用

目的:了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性,确定甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核重组表达产物rPagC免疫原性和保护作用。方法:采用PCR及其产物测序了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性。构建甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯表达的rPagC。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测rPagC表达情况及其产量。采用免疫扩散法、ELISA和Western Blot鉴定其抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rPagC对甲型副伤寒杆菌感染的免疫保护效果,微量肥达试验检测rPagC免疫小鼠血清凝集伤寒和副伤寒沙门菌的效果。结果:所有被检测的甲型副伤寒沙门菌临床菌株均携带pagC基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.1%～100%和98.4%～100%。所构建的原核表达系统能高效表达rPagC。rPagC免疫家兔可产生高效价抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号。ELISA结果显示,97.1%(66/68)甲型副伤寒患者血清标本rPagC抗体阳性。100μg和200μg rPagC对感染小鼠的免疫保护率分别为73.3%(11/15)和86.7%(13/15)。rPagC免疫小鼠血清对甲型副伤寒沙门菌和伤寒沙门菌H抗原凝集效价高达1∶10～1∶40。结论:pagC基因在甲型副伤寒沙门菌株中分布广泛。rPagC有良好的免疫原性及较强的免疫保护作用,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原。

肠炎沙门菌pagC基因缺失株构建及其相关生物学特性研究

目的研究肠炎沙门菌外膜蛋白PagC的生物学功能以及在肠炎沙门菌致病过程中的作用。方法利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336)pagC基因缺失突变(C50336Δhtra),在此基础上构建基因回补菌株。测定肠炎沙门菌各菌株在培养基中的生长曲线;利用生化鉴定系统测定各菌株的生化特性;分析肠炎沙门菌各菌株在酸性、碱性和高渗环境下的存活能力;利用K-B纸片法测定肠炎沙门菌各菌株的耐药性。结果成功构建了肠炎沙门菌pagC基因缺失株C50336ΔpagC。生长曲线显示,与野生型菌株和回补菌株相比,C50336ΔpagC缺失株生长速度、生化特性无明显差异,表明pagC不影响肠炎沙门菌的生长特性。应激实验结果显示,pagC基因缺失后,肠炎沙门菌应对酸碱应激和高盐应激能力显著下降,表明pagC影响肠炎沙门菌应激条件下生存。药物敏感性试验结果显示,pagC基因缺失后,肠炎沙门菌对多种抗菌药物敏感性增高,表明pagC参与肠炎沙门菌耐药过程。结论PagC蛋白与细菌抗环境应激和耐药性相关,为进一步阐释肠炎沙门菌致病机制和耐药机理奠定基础。