PAX4基因A1168C多态性与中国汉族人1型糖尿病的相关性

目的探讨中国汉族人群PAX4基因A1168C多态性与1型糖尿病的相关性。方法随机选取无亲缘关系的中国汉族人360例,其中1型糖尿病患者109例,无糖尿病及糖尿病家族史且空腹葡萄糖<5.60mmol/L的对照组251名。采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性技术(PCR-RFLP)检测A1168C多态性,SPSS软件分析A1168C多态性的基因型频率和等位基因频率及其组间差异。结果对照组和1型糖尿病组基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。1型糖尿病患者基因型频率及等位基因频率与对照组相比差异均无显著性(P>0.05)。将1型糖尿病组按性别和发病年龄分层,各组基因型频率和等位基因频率与对照组相比差异仍无显著性(P>0.05)。结论PAX4基因A1168C多态性可能与中国汉族1型糖尿病的发生无关。

PAX4基因多态性与胰岛自身抗体阴性酮症倾向糖尿病的关系

目的:探讨配对盒4(paired box4,PAX4)基因多态性与胰岛自身抗体阴性酮症倾向糖尿病(KPD)的关系。方法:应用变性高效液相色谱法(DHPLC)筛查141例谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD-Ab)和蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体(IA-2Ab)阴性的KPD患者(KPD组)和112例非糖尿病对照者(NC组)的PAX4基因外显子3和9,对异常峰型者经测序证实其碱基改变。应用聚合酶链反应-限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)法对141例KPD患者和308例对照者的PAX4基因A1168C多态位点进行等位基因和基因型频率分析。结果:在本组人群中未发现PAX4基因外显子3有变异。外显子9中的单核苷酸多态性(SNP)位点A1168C,引起错义突变P321H(rs712701)。A1168C位点的C等位基因和CC基因型频率在KPD组与NC组间差异无统计学意义;按性别分层后,KPD组C等位基因和CC基因型频率差异均有统计学意义(P=0.009,0.028);以年龄分层后,<20岁组与≥20岁组比较C等位基因和CC基因型频率分布差异均有统计学意义(P=0.034,0.032);在CC基因型的KPD患者中,空腹C肽(FCP)水平高于AA基因型者,差异有统计学意义(P=0.005)。结论:本组中国南方汉族人群PAX4基因A1168C(P321H)多态性与胰岛自身抗体阴性KPD未见关联,但分层研究提示PAX4基因A1168C多态性对男性和<20岁的KPD患者的发病可能有影响。

NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

目的:运用pADxsi系统构建带人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体。方法:采用基因克隆技术,将目的基因NGN3从pEGFP-N1-NGN3质粒上切下连到pShuttle-GFP-CMV上,替换GFP,得到pShuttle-CMV-NGN3;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上切下连到系统pShuttle-CMV-NGN3上,得到pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4穿梭质粒;最后将CMV-NGN3/CMV-PAX4从pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架载体上,得到pADxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4病毒质粒,然后在293细胞中进行包装与扩增活性病毒,并进行病毒滴度测定。体外感染人脐带间充质干细胞。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与免疫印迹(Western blotting)检测目的基因在细胞内的表达情况,免疫细胞化学与间接荧光法检测目的分子在细胞内的定位。结果:酶切鉴定和PCR证明重组人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;RT-PCR与Western blotting结果显示目的基因在细胞持续稳定表达;间接荧光与免疫化学表明重组腺病毒可高效感染人脐带间充质干细胞,且目的基因特异性地定位于细胞核内。结论:应用重组技术成功构建人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体,且在间充质干细胞内持续而稳定表达。

β细胞发育必需调节因子PAX4与糖尿病

PAX是一类重要的转录调控因子，在胚胎发育过程中对组织和器官的特异分化起着重要的调控作用。PAX4是PAX家族中的一员，其主要功能是作为胰腺早期发育的转录抑制因子，在胰腺β细胞发育过程中发挥重要作用。有研究发现PAX4基因的某些特异突变与糖尿病有关。深入研究PAX4参与调控早期β细胞分化的分子机制，将有助于从胰腺或胚胎干细胞中诱导分化功能性β细胞的研究，为探讨糖尿病治疗新策略提供重要依据。

转录因子Pax4蛋白质转导功能的研究

目的探讨胰腺相关转录因子Pax4是否具有蛋白质转导功能,及其进入细胞后的生物学功能。方法Ni柱亲和层析纯化原核表达的含His标签的Pax4全长蛋白质及一系列Pax4突变体与EGFP的融合蛋白。融合蛋白孵育的细胞,分别用于进胞检测和Pax4转导后的功能检测。结果外源纯化的Pax4蛋白能够转导进入HELF细胞。Paired-EGFP融合蛋白可以进入包括大鼠胰岛细胞在内的多种细胞。转导进入细胞的Pax4蛋白能够减少TNFα引发的胰岛细胞凋亡,增加胰岛细胞体外培养的存活率。结论研究结果表明转录因子Pax4具有蛋白质转导功能,完整的Paired结构域是Pax4的蛋白质转导结构域（PTD）,外源纯化的Pax4蛋白在转导入胰岛细胞有抑制细胞凋亡的作用。

PDXl与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

运用pADxsi系统制备可表达人PDX1与PAX4双基因的重组5型腺病毒。从pEGFP-N1-PDX1质粒上酶切下目的基因PDX1并酶连到腺病毒穿梭质粒pShuttle-EGFP-CMV上,替换EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上酶切下连到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位点而得到穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4;双酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4将CMV-PDX1/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架质粒上,得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒质粒,然后在293细胞中进行包装并扩增重组腺病毒,并进行病毒滴度测定;体外感染人间充质干细胞。依据酶切、测序和PCR的结果均证明重组人PDX1与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;而RTPCR与WB结果也显示目的基因在细胞中稳定表达。应用重组技术成功构建人PDX1与PAX4双基因表达5型腺病毒载体,转录因子PDX1与PAX4在间充质干细胞内稳定表达且定位于细胞核内。

神经元素3与成对盒基因4促进胰腺十二指肠同源框蛋白1诱导间充质干细胞向胰腺分泌细胞分化

目的:探索神经元素3(neurogenin 3,NGN3)与成对盒基因4(paired box gene 4,PAX4)对胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox factor1,PDX1)驱动间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向胰腺β细胞分化过程中的作用。方法:构建PDX1基因及NGN3与PAX4双基因表达腺病毒,重组腺病毒Adxsi-CMV-PDX1感染诱导MSCs1周后,再行重组腺病毒Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4感染诱导MSCs;分别检测PDX1、PAX4、NGN3、NK转录因子相关的2.2(NK transcription factor related,gene family 2,locus2,NKX2.2)、v-maf muscu-loaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B(MafB)、胰岛素(Insulin)、胰高血糖素(Glucagon)多种胰腺分泌细胞相关分子表达情况。结果:成功构建腺病毒Adxsi-CMV-PDX1与Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4;MSCs经Adxsi-CMV-PDX1与Adxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4分步诱导后,免疫细胞化学与间接荧光检测显示PDX1、NGN3与PAX4因子在细胞核内稳定表达;重组腺病毒稳定转染5 d后,细胞开始变圆并集聚成团,用双硫腙(dithizone,DTZ)染色细胞质呈亮红色;细胞经诱导1周后,用RT-PCR检测到神经源分化因子1(neurogenic differentiation 1,NruroD1)与NKX2.2表达,2周后可检测胰岛素/胰岛素原分子;间接荧光检测显示诱导后的细胞先后开始表达NKX2.2、MafB等转录因子与胰岛素/胰岛素原、胰高血糖等胰岛分泌细胞相关分子,但未能检测到v-maf musculoaponeurotic fibro-sarcoma oncogene homolog A(MafA)与C肽分子表达。结论:NGN3与PAX4对PDX1诱导间充质干细胞向胰腺分泌细胞分化具有促进作用。

敲降HE4和PAX8基因对TC方案治疗上皮性卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨敲降人附睾蛋白4(HE4)和配对盒基因8抗原(PAX8)基因后对紫杉醇药+铂类药(TC方案)治疗的上皮性卵巢癌OVCAR3细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。方法:分别设计和合成敲降HE4和PAX8的单靶siRNA(HE4-siRNA或PAX8-siRNA)及双靶siRNA(HE4+PAX8-siRNA)和阴性siRNA序列,并与质粒载体pGCsi-H1相连形成重组质粒,分别转染人上皮性卵巢癌OVCAR3细胞形成HE4-siRNA组、PAX8-siRNA组、HE4+PAX8-siRNA组和siRNA-NC组,同时设立空白对照组(无任何处理)。用TC方案(紫杉醇3.13μg/ml+卡铂2.82μg/ml,)分别处理上述5组细胞后,用MTT法、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验、流式细胞术检测各组细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡能力的变化。结果:敲降HE4和PAX8基因后,与siRNA-NC组和空白对照组比较,HE4-siRNA组、PAX8-siRNA组、HE4+PAX8-siRNA组卵巢癌OVCAR3细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低(均P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),尤以同时敲降HE4和PAX8基因的效果更佳。结论:敲降HE4和PAX8基因均可增强TC方案抑制上皮性卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭能力并促进其凋亡,尤以HE4和PAX8基因同时敲除的效果更好。

PAX4基因C1168A位点基因多态性与糖尿病易感性关系的Meta分析

目的分析配对盒4(PAX4)基因C1168A位点基因多态性与糖尿病易感性的关系。方法文献检索中文数据库(中国知网、万方、维普及中国生物医学文献数据库)及英文数据库(Web of Knowledge,Pub Med,EBSCO),并通过手工检索及其他检索,纳入2017年6月前关于PAX4基因C1168A位点基因多态性与糖尿病易感性相关的病例对照研究。通过漏斗图检验入选文献是否偏移,运用Rev Man5.3软件对数据进行异质性检验及数据合并,并计算比值比(OR)。结果最终纳入8篇文献(10组研究),病例组3 118例,对照组4 111例。Meta分析发现,携带AA基因型与CC/AC基因型[OR=1.00,95%CI(0.88-1.14),P=0.97],携带CC基因型与AA/AC基因型[OR=1.02,95%CI(0.91-1.14),P=0.71],携带CC基因型与AA基因型[OR=1.01,95%CI(0.85-1.21),P=0.90]个体间2型糖尿病发病风险差异均无统计学意义。亚组分层分析显示,携带AA基因型与CC/AC基因型白种[OR=0.90,95%CI(0.70-1.16),P=0.41]和黄种人群[OR=1.04,95%CI(0.89-1.21),P=0.60],携带CC基因型与AA/AC基因型白种[OR=1.03,95%CI(0.90-1.18),P=0.67]和黄种人群[OR=1.00,95%CI(0.82-1.23),P=0.97]的2型糖尿病发病风险差异均无统计学意义。结论 PAX4基因C1168A位点基因多态性与2型糖尿病易感性间无显著关联。

携带成对盒4基因突变早发糖尿病1例报道并文献复习

目的探讨成对盒4(paired box 4,PAX4)基因突变致早发糖尿病临床特征,进一步提高对该疾病的认识。方法回顾1例携带PAX4基因突变早发糖尿病患者临床资料,并进行文献复习。结果患者,女,25岁,因“乏力、口渴、多饮、多尿40余天,恶心、纳差4 d”入院,诊断“糖尿病酮症酸中毒”,胰岛素自身抗体检测阴性,住院期间应用多种降糖药物治疗,疗效欠佳,胰岛分泌功能衰竭;基因检测PAX4基因外显子5上第192位密码子(CGT)G>A杂合变异,为R192H型。结论对于疑似单基因糖尿病患者,基因测序分析具有重要意义,尤其在诊断和分型方面,准确的基因诊断有助于患者得到更专业的治疗。