基于代谢组学的白黄链霉菌TD-1高产帕马霉素代谢机制

真菌毒素给食品安全带来了重大威胁,帕马霉素对病原真菌有良好的生物抑菌活性。为提高帕马霉素产量,基于代谢组学分析方法,研究了白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)T D-1在两种不同发酵培养基(添加与不添加1,2-丙二醇)中生长及代谢、胞内代谢产物及代谢通路的差异,对代谢产物的变化进行了评估和分析,结合显著差异代谢产物含量变化与代谢通路的交互关系,揭示了帕马霉素生物合成的高产机理。结果表明:培养基添加1,2-丙二醇后,白黄链霉菌T D-1产帕马霉素产量明显提高。利用气相色谱-质谱联用技术,鉴定出27种显著差异胞内代谢产物与帕马霉素生物合成密切相关,主要参与中心碳代谢、氨基酸代谢及脂肪酸代谢通路。此外,通过采用添加主要显著差异前体物策略,添加谷氨酸使帕马霉素产量提高102.33%。基于代谢组学分析确定添加前体物方法,可有效提高帕马霉素产量。本研究旨在为防治粮食加工食品的黄曲霉及黄曲霉毒素污染,从源头保障食品安全提供技术参考。

白黄链霉菌T D-1产帕马霉素对黄曲霉2219等霉菌的抑制作用

为研究微生物及其次级代谢产物对黄曲霉2219等霉菌的抑制机理,以分离于土壤中的白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)T D-1为研究对象,利用薄层色谱、硅胶柱层析、高效液相色谱和液相-质谱联用技术对其代谢产生的活性物质——帕马霉素进行分离。利用扫描电子显微镜、荧光显微镜和高效液相色谱方法研究帕马霉素对黄曲霉2219等霉菌生长的抑制效果及抑制机理。结果表明,白黄链霉菌T D-1上清液和菌丝体中活性物质的分子式预测为C_(35)H_(61)NO_(7),为帕马霉素及其同系物,相对分子质量为593、607、621、635、649。通过扫描电子显微镜观察帕马霉素处理后的霉菌细胞形态,其孢子和菌丝体会发生不同程度畸变。帕马霉素对桔青霉的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)为0.125 mg/mL,对灰霉的MIC为0.500 mg/mL,对黄曲霉2219、黑曲霉、哈茨木霉和米曲霉的MIC均为1.000 mg/mL。帕马霉素对霉菌的作用靶点为其细胞膜的麦角甾醇,抑制机制是破坏细胞壁的完整性,改变细胞膜的通透性,影响线粒体的能量代谢,抑制菌丝细胞膜中麦角甾醇的生物合成。帕马霉素对黄曲霉2219产生黄曲霉毒素B 1的抑制率达到98.3%。因此,可利用白黄链霉菌T D-1及其代谢产物帕马霉素对食品原料中的产毒真菌污染进行生物防治。

一种开发农用抗生素的新方法——以与作物病原菌相关的天然生理活性物质作为开发的源泉

介绍了创制新农用抗生素的新方法,此法对传统方法是一个革命性的挑战。

林可链霉菌NRRL 2936中帕马霉素生物合成基因簇的异源表达及调控基因功能研究

【背景】帕马霉素属于大环内酯类抗生素,具有较好的抗感染活性。该类化合物独特的化学结构和显著的生理活性受到了许多研究者的关注。同时,本实验室在林可链霉菌NRRL2936的全基因组序列中发现了帕马霉素的生物合成基因簇。【目的】尽管其生物合成途径已经得到了解析,但其生物合成基因簇中的2个调控基因功能尚不清楚。本研究从林可链霉菌NRRL2936的基因组文库中克隆了含有帕马霉素生物合成完整基因簇的质粒pJQK450,开展了质粒pJQK450在链霉菌中的异源表达,实现了帕马霉素的异源合成,并初步确定该生物合成基因簇中两个调控基因的功能。【方法】利用聚合酶链式反应递缩基因组文库筛选的方法,从林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)NRRL 2936基因组文库中筛选到了含有帕马霉素生物合成完整基因簇的Fosmid质粒pJQK450。然后,将该质粒转化到E.coli ET12567/pUZ8002中,利用大肠杆菌-链霉菌双亲接合转移的方法将pJQK450转入异源宿主中。对获得的异源表达菌株进行发酵产物的制备,采用耻垢分枝杆菌mc2155作为指示菌株进行帕马霉素生物活性测试,并结合LC-MS的分析确定帕马霉素的产生情况。最后,通过基因失活与回补的方法,考察帕马霉素生物合成基因簇中调控蛋白PamR1和PamR2对帕马霉素生物合成的影响。【结果】帕马霉素生物合成基因簇在天蓝色链霉菌M1154中实现了表达,证明PamR1和PamR2负调控了帕马霉素生物合成的过程。【结论】帕马霉素完整基因簇的成功异源表达,一方面便于其生物合成途径的遗传改造,为帕马霉素的生物合成及优产改造研究奠定了基础;另外,调控基因功能的研究为帕马霉素的产量优化提供了改造的目标。