新型冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的建立与应用

目的:以新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(PLpro)为靶点,利用荧光共振能量转移(FRET)技术,建立用来筛选PLpro抑制剂的高通量筛选(HTS)模型。方法:通过大肠杆菌原核表达系统进行质粒构建、原核表达、分离纯化,获得高活性PLpro(以FRET检测PLpro生物活性),用的底物为两端被荧光基团Edans与淬灭基团Dabcyl修饰的多肽。通过优化实验条件,建立并评价PLpro抑制剂FRET高通量筛选模型,筛选苗头化合物。结果:利用大肠杆菌原核表达系统成功表达并分离出PLpro,其比活力>3000 U/mg。经过优化实验,确定模型筛选条件:设定HEPES缓冲液(pH 7.0)中NaCl浓度为50 mmol/L,孵育温度为25℃,孵育时间为30 min,PLpro浓度为18μmol/L,底物浓度为2μmol/L。测得Z′因子值为0.74,说明所建模型可用于高通量筛选。通过对天然产物化合物库进行筛选,发现十七烷一烯银杏酸(GA17∶1)对PLpro具有混合型抑制作用且IC50值为15.5μmol/L。结论:成功建立PLpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步确定GA17∶1是一种新型抗PLpro的苗头化合物,该筛选方法对于快速筛选新型冠状病毒PLpro的靶向抑制剂具有十分重要的意义。

大豆胰蛋白酶抑制失活诸方法研究探讨

研究了大豆制品———豆奶中胰蛋白酶抑制剂的三种失活方法 :热处理失活、木瓜蛋白酶水解失活及茶多酚络合失活。实验证明 ,这三种方法都可以有效的使胰蛋白酶抑制剂活性降低。同时都有其最佳失活条件 ,否则将影响其产品质量或胰蛋白酶抑制剂的失活效果 :热处理过度 ,会使豆奶产生焦味和褐变 ;木瓜蛋白酶的加入量达到最佳值后胰蛋白酶的活性趋于稳定而不再呈上升的趋势 ;茶多酚的用量过多时 ,剩余量会对胰蛋白酶产生抑制作用而降低失活效果。本文同时还探讨了温度、受热时间对茶多酚与大豆胰蛋白酶抑制剂络合物的影响 ,温度偏高或加热时间过长 ,络合物就会部分解络 ,从而达不到预期的效果。

大豆胰蛋白酶抑制剂失活方法的研究

研究了豆奶中胰蛋白酶抑制剂的三种失活方法：热处理失活、木瓜蛋白酶水解失活及茶多酚络合失活。实验证明，这三种方法都可以有效地使胰蛋白酶抑制剂活性降低。同时都有其最佳失活条件，否则会影响其产品质量或影响胰蛋白酶抑制剂的失活效果：热处理过度，会使豆奶产生焦味和褐变；木瓜蛋白酶的加入量达到最佳值后胰蛋白酶的活性趋于稳定而不再呈上升的趋势；茶多酚的用量过多时，剩余量会对胰蛋白酶产生抑制作用而降低失活效果。同时还探讨了温度、受热时间对茶多酚与大豆胰蛋白酶抑制剂络合物的影响，温度偏高或加热时间过长，络合物就会部分解络，从而达不到预期的效果。

蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10纯化及生物学功能研究

蒙古黄芪病程相关蛋白(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein 10,AmPR-10)在蒙古黄芪遭遇环境压力和病原体侵袭时大量表达,该研究旨在探讨AmPR-10的生物学功能。蒙古黄芪干燥根经机械粉碎后缓冲液浸提得到蒙古黄芪总蛋白粗提液,总蛋白粗提液经阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱纯化后得到电泳纯AmPR-10。以不同RNA为底物,通过检测260 nm吸光度分析核酸酶活性,结果显示AmPR-10对Yeast tRNA,Yeast RNA,Poly(A)和Poly(C)均表现核酸酶活性,且其最佳反应温度为50℃,最佳反应pH为78,EDTA对其活性无影响,Mg^2+对其活性具有激活作用,Co^2+,Ca^2+和Zn^2+对其活性具有抑制作。AmPR-10与已知核酸酶无序列同源性,可能是一种新的核酸酶。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法分析AmPR-10木瓜蛋白酶抑制活性,结果显示AmPR-10是木瓜蛋白酶的非竞争性抑制剂。AmPR-10可能通过抑制半胱氨酸酶活性在蒙古黄芪对抗环境压力和抵御病原体侵袭的过程中发挥重要作用。

新型冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂的虚拟筛选与活性验证

目的通过分子对接的虚拟筛选和体外酶活性测试,获得具有新型骨架结构的新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(PL^(pro))抑制剂。方法利用分子对接筛选商业化合物库与自有化合物库,根据打分排序以及相互作用模式分析,挑选苗头化合物,通过荧光共振能量转移法测定化合物对PL^(pro)酶活性的抑制效力。结果从分子对接后的打分排序以及相互作用模式分析中,挑选了20个分子。通过FRET方法测试酶活性,发现了2个化合物(Y949、C528)对新型冠状病毒PL^(pro)具有抑制活性,其半数最大抑制浓度分别为97.7、145.0μmol·L^(-1)。结论通过虚拟筛选和体外酶活性测试,获得了两个具有新骨架结构的PL^(pro)抑制剂,为靶向PL^(pro)抗新型冠状病毒创新药物的研发提供了苗头化合物。