3种不同膝骨关节炎造模方法比较

目的比较卵巢切除法、木瓜蛋白酶法、改良Hulth法3种方法在不同时间节点血清炎症因子、病理表现及关节软骨胶原蛋白(Collagen)Ⅱ的表达,了解膝骨关节炎不同造模方法的造模效果及特点。方法选取清洁级雌性SD大鼠80只,采用随机数字表法分别设立空白对照组(6 w组、10 w组)、卵巢切除法组(6 w组、10 w组)、木瓜蛋白酶法组(6 w组、10 w组)、改良Hulth法组(6 w组、10 w组),每组10只。除空白对照组外,其余组按照相应方法建立膝骨关节炎模型。分别于建模后第6周、第10周处死相应组别大鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、基质金属蛋白酶(MMP)-3含量,镜下观察大鼠膝关节形态并用改良Mankin标准进行病理评分,免疫组化法检测膝关节软骨CollagenⅡ型胶原表达。结果造模6 w时,与空白对照组对比,卵巢切除法组TNF-α、MMP-3含量、改良Mankin评分及膝关节软骨CollagenⅡ表达未见明显差异(P>0.05)。与空白对照组、卵巢切除法组对比,木瓜蛋白酶法组、改良Hulth法组血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量、改良Mankin评分明显增高,关节软骨CollagenⅡ表达明显降低(P<0.05)。造模10 w时,与空白对照组对比,卵巢切除法组血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量、改良Mankin评分及关节软骨CollagenⅡ表达未见明显差异(P>0.05)。与空白对照组及卵巢切除法组对比,木瓜蛋白酶法组、改良Hulth法组血清IL-6、TNF-α、MMP-3含量、改良Mankin评分明显增高,关节软骨CollagenⅡ表达明显降低(P<0.05)。与木瓜蛋白酶法组对比,改良Hulth法组血清TNF-α、MMP-3含量、改良Mankin评分明显更高,关节软骨CollagenⅡ表达明显更低(P<0.05)。结论在第10周时,卵巢切除法未能成功建立膝骨关节炎模型。木瓜蛋白酶法和改良Hulth法均可在第6周时快速、有效地建立膝骨关节炎模型。而改良Hulth法随着造模时间增加,在炎症反应表现更加持久和膝关节病理改变严重程度更高。

不同浓度木瓜蛋白酶建立兔膝骨关节炎模型的比较研究

目的:比较不同浓度木瓜蛋白酶建立的兔膝骨关节炎模型,为研究骨关节炎病理及诊疗方法提供数据支持。方法:将60只新西兰大耳白兔随机分为4组,分别在1、3、5d右膝关节腔注射2%(低剂量组)、5%(中剂量组)、10%(高剂量组)(w/v)木瓜蛋白酶和0.03mol/L的L-半胱氨酸混合溶液0.1ml/kg(实验组),以及等量生理盐水(对照组)。整个实验过程观察兔状态并记录体重和膝关节宽度。首次注射后第2、4、6周将兔分批处死,取股骨髁、胫骨平台及滑膜做大体及组织病理学观察,并进行评分。结果:实验组均出现关节宽度增大、关节软骨变薄、基质分解破坏、滑膜增生等炎症及退行性改变,严重程度随浓度增高而增高,也随时间延长而发展;对照组无上述改变,二者比较差异有统计学意义。结论:兔膝骨关节腔注射2%、5%、10%木瓜蛋白酶和0.03mol/LL-半胱氨酸混合溶液0.1ml/kg可制备不同严重程度的骨关节炎模型,周期短,可重复且成功率高。

应用木瓜蛋白酶建立绵羊肺气肿模型

目的:应用木瓜蛋白酶局部气管内滴注法复制绵羊不均一肺气肿模型。方法:绵羊气管内插管,局部肺段滴注木瓜蛋白酶,机械正压通气15min制作肺气肿模型。观察影像学及肺组织病理学改变。结果:11只绵羊成功复制出肺气肿模型,成功率84.6%。CT示气肿肺段肺纹理减少,肺野透过度增加。病理观察光镜示肺泡壁菲薄,胀大,弹力纤维破坏,肺泡融合,符合肺气肿表现。结论:木瓜蛋白酶局部气管内滴注能成功复制绵羊不均一肺气肿模型。

用木瓜蛋白酶建立兔颞颌关节骨关节炎模型的研究

目的 :探讨采用木瓜蛋白酶在兔颞颌关节上腔注射 ,建立兔颞颌关节骨关节炎动物模型的可行性。方法 :对6只日本大耳白兔行颞颌关节上腔注射 ,实验侧注射 0 3ml 1 6 %木瓜蛋白酶溶液 ,对照侧注射 0 3ml生理盐水 ,1周后重复 1次 ,首次注射后第 2、4、6周分批处死实验动物 ,切取颞颌关节做大体及组织病理学观察。结果 :实验侧关节注射木瓜蛋白酶后出现关节软骨变薄、基质分解破坏、滑膜增生等炎症及退行性改变 ,并随观察时间的延长而进一步发展 ,但在首次注射后第 6周时出现不同程度的修复性改变。结论 :兔颞颌关节注射木瓜蛋白酶后的改变与人颞颌关节骨关节炎病理改变具有相似性 ,可重复 ,可作为研究颞颌关节骨关节炎病理。

酶解法制备乌鸡蛋白肽的动力学研究

以乌鸡蛋白为底物,研究了木瓜蛋白酶在酶解乌鸡蛋白制备乌鸡蛋白肽时的一级热失活、拟态条件下的米氏常数,建立了考虑底物反竞争性抑制和产物竞争性抑制等影响因素下的反应动力学模型,并根据实验结果求得在70℃下的酶催化水解反应动力学常数Kd为0.011 3min-1,Km为5.70×10-3mol/L,Kcat为1.589 8min-1,并得到了相应的水解度动力学模型和反应速度动力学模型.

木瓜蛋白酶与石膏制动建立兔膝骨关节炎模型的比较

目的比较木瓜蛋白酶关节腔注射与关节石膏伸直位制动建立兔膝骨关节炎模型的效果。方法将21只实验兔采用随机区组分组法分为正常组、木瓜蛋白酶组及石膏组,每组7只。木瓜蛋白酶组予6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液于实验开始第1、4、7天行右膝关节腔注射,注射结束4周后造模完成;石膏组予膝关节伸直位固定6周;记录实验期间动物不良情况发生率,造模完成后处死实验兔,取软骨标本进行大体观察、Pelletier评分、Mankin's评分,免疫组化测定软骨Ⅱ型胶原蛋白含量,ELISA法检测血清和关节液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)以及基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的含量。结果大体观察显示木瓜蛋白酶组与石膏组均出现关节肿胀、关节间隙变窄、软骨缺损、滑膜增生硬化、炎症改变、骨赘形成;Pelletier评分、Mankin's评分、Ⅱ型胶原蛋白含量、血清和关节液中TNF-α、COMP以及MMP-3的含量,木瓜蛋白酶组、石膏组与正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);木瓜蛋白酶组与石膏组比较,上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。木瓜蛋白酶组动物不良情况发生率明显低于石膏组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论木瓜蛋白酶关节腔注射与石膏关节伸直位制动均能成功建立膝骨关节炎模型,但木瓜蛋白酶关节腔注射法更为快捷、简便,并发情况少,可行性好。

兔肺气肿模型的建立

目的 应用木瓜蛋白酶雾化吸入和静脉注射法来复制兔肺气肿模型。方法 兔耳缘静脉注入 8%木瓜蛋白酶和让兔雾化吸入 5 %木瓜蛋白酶液制作模型。观测其动脉血气及肺功能并对肺组织进行病理学观察。结果 与正常组相比模型组兔动脉血pH值、PaO2 浓度降低 ,PaCO2 浓度升高 ;潮气量下降 ,呼吸总阻力、中心阻力、总气道阻力升高 ;病理组织切片光镜下见肺泡壁变薄、断裂 ,肺泡腔扩张、融合 ,典型肺气肿表现。结论 木瓜蛋白酶雾化吸入和静脉注射能成功复制出兔肺气肿模型。

关节腔内注射不同浓度木瓜蛋白酶建立小鼠膝骨关节炎模型的研究

目的探讨关节腔内注射不同浓度木瓜蛋白酶建立小鼠膝骨关节炎模型的可行性。方法健康10周龄雄性昆明小鼠80只,体重(45±3)g,随机分为2%木瓜蛋白酶组、4%木瓜蛋白酶组、8%木瓜蛋白酶组和对照组。实验第1、3、5天分组行右膝关节腔内注射2%、4%、8%(w/v)木瓜蛋白酶和0.3mol/LL-半胱氨酸的混合溶液0.25 m L/kg或等量生理盐水。记录小鼠一般情况及右膝关节宽度。所有小鼠首次注射1周后处死,取关节行常规HE染色及甲苯胺蓝染色,镜下观察并评分。结果造模组右膝关节出现肿胀、功能障碍;右膝关节软骨染色变浅、软骨层变薄、基质分解破坏等病理学改变,其严重程度与木瓜蛋白酶浓度呈正相关;对照组无上述改变。结论膝关节腔内注射2%、4%、8%(w/v)木瓜蛋白酶和0.3mol/L L-半胱氨酸的混合溶液0.25 m L/kg可建立小鼠不同严重程度的膝骨关节炎,周期短、成功率高。

纤维素亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附特性

以纤维素滤纸膜为载体,染料汽巴蓝F3GA为配基,制备出一种新型亲和膜色谱介质。分别在277,298,310K的均衡实验条件下,批量法对木瓜蛋白酶进行等温吸附测定。所得的数据用准一级动力学模型和准二级动力学模型进行分析。结果表明:准二级动力学模型具有更好的相关性,纤维素染料亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附符合Lang-muir吸附模型,在298K条件下吸附现象的热力学参数:ΔGΘ,ΔHΘ,ΔSΘ分别为-7.71kJ/mol,34.91kJ/mol和0.143kJ/(mol.K),染料纤维素亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附是自发的,并且是吸热过程。

低浓度木瓜蛋白酶诱导兔早期膝骨关节炎滑膜炎症的时间曲线

背景:膝关节滑膜炎症在早期膝骨关节炎的发生发展中起重要作用。目的:比较低浓度木瓜蛋白酶不同诱导时间下兔膝骨关节炎滑膜炎症的变化,为研究膝关节滑膜炎提供数据支持。方法:将24只新西兰大耳白兔随机分为4组,分别在第1,4,7天右膝关节注入2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液0.5 m L,在末次注射后第1,2,3周将兔子分批处死,空白对照组在第3周处死,记录兔膝关节局部皮温和周径,并取滑膜及髌下脂肪垫组织行病理学观察及酶联免疫吸附测定。结果与结论:(1)在造模后第1周有大量关节积液,膝关节局部皮温及周径均高于第2,3周;(2)滑膜组织中白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13浓度在第1,2,3周均高于空白组,且第1周时浓度最高,第2,3周差异无显著性意义;(3)滑膜组织形态学显示,第1,2,3周滑膜组织均增生、变厚,有炎性细胞浸润,随着造模时间的延长,滑膜组织中血管增生明显增加;(4)说明低浓度木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合在1周内能形成兔膝关节滑膜炎症,并产生大量关节积液,随时间增加滑膜组织增厚、血管增生明显,关节积液减少。

木瓜蛋白酶在PEG/PEG-IDA-Fe^(3+)/(NH_4)_2SO_4亲和双水相中的分配系数模型

为预测木瓜蛋白酶在PEG/PEG-IDA-Fe3+/(NH4)2SO4亲和双水相中的分配行为,在298.15K条件下利用浊点法测定并比较了PEG/(NH4)2SO4和PEG/PEG-IDA-Fe3+/(NH4)2SO4的三角相图,建立了木瓜蛋白酶在无亲和配基双水相和含亲和配基双水相中分配模型。考察双水相各组分浓度与木瓜蛋白酶在该体系中分配系数的相关度,基于酶分配系数与双水相中上下相组分浓度差之间较高相关度,提出了木瓜蛋白酶在PEG/(NH4)2SO4双水相中分配系数与上下相组分浓度差的关联模型,模型相对偏差为7.02%。引入亲和配基浓度对酶分配系数的影响因子η,提出了木瓜蛋白酶在PEG/PEG-IDA-Fe3+/(NH4)2SO4亲和双水相中分配系数模型,试验验证,预测值和试验值之间相对误差均在15%以内,能实现亲和双水相中酶的准确预测。研究结果为木瓜蛋白酶在双水相中分配系数的工程计算提供参考。

木瓜蛋白酶在[C_nmim]BF_4-NaH_2PO_4双水相体系中的分配行为

为了研究木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-Na H2PO4双水相体系中的分配行为,在298.15 K条件下利用浊点法测定了[Cnmim]BF4-Na H2PO4双水相体系的双节线和液液相平衡数据,建立了木瓜蛋白酶在该体系中的三维分配模型。利用Merchuk方程、Othmer-Tobias方程和Bancroft方程分别关联了双节线数据、液液相平衡数据,拟合度分别在0.975、0.994以上,结果满意。木瓜蛋白酶分配系数的对数与该体系上相的离子液体浓度和下相的盐浓度相关度都较高,故通过Matlab建立了三者之间的分配模型,实验值和预测值之间的相对偏差均在5%以内,表明该模型能有效地预测木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-Na H2PO4双水相体系中的分配行为。

一种高效便捷的家兔肺气肿模型建立方法

目的应用猪胰蛋白酶气管注入同时联合木瓜蛋白酶静脉注射法来建立家兔肺气肿模型。方法将家兔随机分为模型组及对照组。模型组兔耳缘静脉注入8%木瓜蛋白酶同时5%猪胰蛋白酶气管注入制作模型。对照组:家兔经环甲膜穿刺一次性注入生理盐水1 ml/kg。再经家兔耳缘静脉一次性注入生理盐水1 ml/kg。观测实验动物动脉血气及肺功能,并对肺组织进行病理学观察。结果与正常对照组相比,模型组兔动脉血Pa CO2升高;而p H值、Pa O2、Sp O2降低;潮气量下降,呼吸总阻力、中心阻力、总气道阻力升高;病理组织切片光镜下见肺泡壁变薄、断裂,肺泡腔扩张、融合,典型肺气肿表现。结论应用猪胰蛋白酶气管注入同时联合木瓜蛋白酶静脉注射法能成功建立兔肺气肿模型。该方法快捷可靠,适用于各种肺气肿动物研究实验。

大鼠滑膜组织中S100A12、IL-1β、Galectin-3与早期膝骨关节炎相关性研究

目的检测早期膝骨关节炎大鼠滑膜组织中的S100A12、IL-1β、Galectin-3水平表达,探讨大鼠滑膜组织中三种炎性细胞因子与早期膝骨关节炎相关性的研究。方法 28只成年雄性Wistar大鼠,随机数字表法分成对照组、实验组。实验组大鼠采用左膝关节腔内注射木瓜蛋白酶诱导早期膝骨关节炎;对照组大鼠相同方法及部位注射等量生理盐水。分别于造模成功后第1、28天提取大鼠滑膜组织,采用免疫组化法和酶联免疫吸附法检测滑膜组织中的S100A12、IL-1β、Galectin-3水平表达。结果①实验组造模成功后第1天检测S100A12、IL-1β、Galectin-3水平表达均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);②实验组造模成功后第28天检测S100A12、IL-1β水平表达均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但Galectin-3水平表达仍较明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论滑膜组织中S100A12、IL-1β、Galectin-3三种炎性细胞因子均与早期膝骨关节炎密切相关,为临床早期诊断膝骨关节炎提供理论依据,同时明确Galectin-3在早期膝骨关节炎病情进展中的持续表达。

早期膝骨性关节炎模型大鼠的建立与验证

背景:木瓜蛋白酶诱导膝关节骨性关节炎与其他化学诱导试剂相比优势在于对胶原蛋白和软骨细胞没有直接影响。目的:通过软骨的表面形态、放射学和组织病理学进一步验证木瓜蛋白酶诱导大鼠早期膝关节骨性关节炎模型的有效性。方法:20只成年雄性Wistar大鼠,由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供,实验方案经南京市六合区人民医院医学伦理委员会批准。将大鼠随机分成对照组和实验组:分别于实验开始后第1,4,7天,给予对照组右膝关节腔内注射4%生理盐水;实验组右膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶。实验开始后第10天观察关节软骨形态,行X射线、三维CT检查;之后麻醉下处死大鼠即刻进行组织病理学检查,并使用Mankins和OARSI评分验证结果。结果与结论:①与对照组相比,实验组大鼠明显跛行,注射侧膝关节肿胀明显,后肢不愿着地;放射学检查可见明显关节间隙变窄,三维CT关节间隙值变小[对照组(0.680 0±0.016 3) mm,实验组(0.558 0±0.033 9) mm,P<0.05];②实验组右膝关节组织显微镜下观察可见早期的炎症特征;2组病理学Mankins和OARSI评分差异均有显著性意义(P <0.05);③结果说明,大鼠右膝关节腔内注射木瓜蛋白酶诱发的早期膝骨性关节炎可用于相关实验研究,因为它提供了关节运动、触觉异常性疼痛、进行性放射性变性和关节软骨微观炎症的可测量变化,代表了骨关节炎评估,为研究早期膝关节骨性关节炎的发病机制提供依据。

阳和汤对兔膝骨关节炎木瓜蛋白酶模型IL-1、TNF-α的影响

目的:观察阳和汤对兔膝骨关节炎模型中白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,探讨阳和汤防治骨关节炎的作用机制。方法:选取4~6月龄健康新西兰兔32只,雌雄各半,体质量(2.25±0.25)kg;采用随机数字表法分为对照组、模型组、阳和汤组、筋骨痛消丸组,每组8只。适应性饲养2周后,除对照组外,其余3组均采用关节腔内注入木瓜蛋白酶复制膝骨关节炎兔模型:轻度弯曲兔膝关节,经关节正中或两侧进针,将1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5 mL通过髌上韧带注入膝关节腔,每隔3天注射1次,连续3次。对照组与模型组予0.9%生理盐水灌胃;阳和汤组予6 g/(kg·d)阳和汤灌胃;筋骨痛消丸组予6 g/(kg·d)筋骨痛消丸灌胃。以上干预均1次/d,每周7次,共干预5周。停药1周后,处死全部实验动物,取兔股骨内髁关节软骨,采用肉眼、光镜下进一步观察苏木素-伊红染色后的关节软骨组织形态学改变情况;采用改良Mankin's评分标准评价软骨退变程度;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清和关节液中IL-1、TNF-α含量。结果:与对照组比较,模型组兔的软骨表面凹凸不平、局部缺损,软骨形态结构紊乱,软骨细胞数量减少,潮线紊乱消失,Mankin's评分增高,血清和关节液中IL-1、TNF-α含量增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,阳和汤组、筋骨痛消丸组兔的软骨缺损减轻,软骨形态结构较整齐,软骨细胞数量增多,潮线清晰,Mankin's评分降低,血清和关节液中IL-1、TNF-α含量降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与筋骨痛消丸组比较,阳和汤组兔的软骨形态结构未见明显区别,血清和关节液中IL-1、TNF-α含量无明显区别,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:阳和汤对骨关节炎的软骨损伤具有修复作用,能有效延缓关节软骨退变,其作用机制可能与抑制IL-1、TNF-α等炎性因子表达有关。

木瓜蛋白酶诱导猪肺气肿模型的建立

目的观察木瓜蛋白酶支气管内注入建立猪肺气肿模型的可靠性。方法分为两组:对照组4只和模型组6只;麻醉动物后,行气管插管,测定各组肺功能、血气分析、CT,然后模型组支气管镜下左肺叶内注入木瓜蛋白酶5 ml(6 U/kg),对照组支气管内注入生理盐水5 ml作为对照,每周一次;于实验结束第五周复测各组肺功能、血气分析、CT及模型组左右肺叶的CT值。分析两组猪血气分析、肺功能、CT值的情况。结果与对照组相比,模型组猪的动脉血气分析PO2降低,PCO2升高;总量、功能残气量、吸气气道阻力、呼气气道阻升高,动态肺顺应性下降,左肺叶CT值较右肺叶下降,比较均有统计学意义;CT示左肺叶内周边肺组织肺纹理减少,肺野透光度明显增强,呈典型的肺气肿的影像学改变。结论木瓜蛋白酶支气管镜下左肺叶内注入法能成功复查猪肺气肿模型。

膝痛方对木瓜蛋白酶诱导的兔膝骨关节炎模型IL-1β、TNF-α、MMP-3的影响

目的观察膝痛方对骨关节炎急发期动物模型白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的调控作用。方法 28只新西兰白兔随机分为空白组、模型组、扶他林组、膝痛方组,各7只,于第1、4、7日向右膝关节内注射2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液0.5 m L(空白组除外)。末次注射7 d后开始治疗。治疗14 d后,测右膝局部皮温,取右膝关节髌下脂肪垫组织处滑膜组织0.3 g,HE染色进行组织病理学观察,ELISA测定滑膜匀浆IL-1β、TNF-α、MMP-3浓度。结果模型组右膝局部皮温略高于其他各组,但各组间差异并无统计学意义(P>0.05);与空白组比较,模型组滑膜增生明显,炎性细胞大量浸润,IL-1β、TNF-α、MMP-3明显升高(P<0.05);与模型组比较,膝痛方组及扶他林组滑膜增生较少,少量炎性细胞浸润,IL-1β、TNF-α、MMP-3降低(P<0.05);与扶他林组比较,膝痛方组IL-1β、TNF-α水平与之差异无统计学意义(P>0.05),而MMP-3则低于扶他林组(P<0.05)。结论膝痛方及扶他林均具有抑制膝骨关节炎急性期滑膜炎症反应的作用,且这种作用可能是通过降低IL-1β、TNF-α、MMP-3而实现的。此外,膝痛方抑制MMP-3的作用优于扶他林,提示膝痛方可能在远期抑制软骨退变,延缓膝骨关节炎病理进程方面具有潜在的疗效,仍需进一步研究。

靶向木瓜样蛋白酶的抗SARS-CoV-2药物虚拟筛选

利用与急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)具有高度同源性的人冠状病毒类木瓜蛋白酶(human coronavirus papain-like protease)晶体,对木瓜样蛋白酶(PLpro)进行同源模建,再通过该模建的蛋白对已上市或已进入临床试验的药物运用分子对接的方法进行虚拟筛选和动力学模拟研究,以找到对SARS-CoV-2引起的新冠肺炎疾病(COVID-19)可能具有治疗作用的药物。经过筛选,共确定了11种与SARS-CoV-2 PLpro结合较好的候选药物。分子动力学模拟和结合自由能分析结果表明:疏水性相互作用在候选药物与PLpro的结合过程中具有重要作用,并且发现替诺福韦艾拉酚胺(Tenofovir alafenamide)具有对COVID-19治疗的潜力。虚拟筛选是一种快速且经济的药物筛选的方法,用此方法筛选得到的替诺福韦艾拉酚胺可能可以作为候选药物对COVID-19进行治疗。

木瓜蛋白酶联合DNA酶法提取乳鼠原代皮层神经元及鉴定

目的采用木瓜蛋白酶联合DNA酶法提取24 h内新生SD大鼠皮层神经元,改进体外原代培养方法。方法取24 h内新生SD大鼠,剥离脑血管膜分离出大脑皮层,采用木瓜蛋白酶和DNA酶顺序消化、纯化后,以含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基为神经元接种液,4 h后更换为预热的含有B27的Neurobasal-A神经元培养液,连续培养7 d。分别以1×10^(5)、5×10^(5)、1×10^(6)细胞/mL接种于L-多聚赖氨酸浸泡后的6孔板内,并在显微镜下观察细胞的生长状态。取培养7 d后的神经元,采用β-Tubulin免疫荧光法和神经元特异性核蛋白(Neun)抗体免疫组化法鉴定神经元,神经元微管相关蛋白2抗体(MAP2)免疫荧光法鉴定神经元纯度。结果神经元以密度为5×10^(5)细胞/mL接种最为合适,接种24 h后,皮层神经元部分贴壁;接种3 d后,贴壁细胞逐渐增多,神经元突触进一步生长并延长,交联成稀疏网络;接种7 d后,神经元仍大量生长,胞体丰满,并形成更为紧密的神经元网络系统。经β-Tubulin免疫荧光法和Neun抗体免疫组化法鉴定,提取培养细胞为神经元,并经神经元标志物MAP2免疫荧光法鉴定神经元纯度为(91.06±1.51)%。结论采用24 h内新生SD大鼠分离大脑皮层,经木瓜酶与DNA酶顺序消化,可提取到优质皮层神经元。