以受番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)侵染的番木瓜(Carica papaya)叶片为供试材料,采用RT-PCR方法克隆其外壳蛋白基因cp,并将其连接到原核表达载体pET-28b(+)上,酶切鉴定及克隆测序确定开放阅读框的正确性,将获得的重组质...以受番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)侵染的番木瓜(Carica papaya)叶片为供试材料,采用RT-PCR方法克隆其外壳蛋白基因cp,并将其连接到原核表达载体pET-28b(+)上,酶切鉴定及克隆测序确定开放阅读框的正确性,将获得的重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌。通过摸索转化的表达宿主菌种类、IPTG浓度及诱导时间,获得高效表达PRSVcp的条件。SDS-PAGE分析结果表明,CP融合蛋白分子量为36.8kD。以Ni2+-NTA亲和层析柱纯化的融合蛋白为抗原,免疫注射新西兰大白兔制备得到高效价抗体,间接ELISA测定效价为1︰16384。Western blot检测结果表明,制备的抗血清可与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。通过ID-ELISA检测田间样品证实了制备的抗血清与PRSV侵染病叶发生了良好的特异性反应。本试验为PRSV的快速检测以及PRSV编码蛋白的功能研究奠定了基础。展开更多
利用电镜和酶联免疫法在云南省采集到的5份南瓜病样中检测到番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）。为了进一步从分子水平确定云南省南瓜病毒病原种类，并为下一步转基因育种提供抗性基因，采用反转录PCR（RT—PCR）方法扩增...利用电镜和酶联免疫法在云南省采集到的5份南瓜病样中检测到番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）。为了进一步从分子水平确定云南省南瓜病毒病原种类，并为下一步转基因育种提供抗性基因，采用反转录PCR（RT—PCR）方法扩增了5个分离物的外壳蛋白（coat protein，CP）基因片段，并克隆到pGEM—T载体中。核苷酸序列测定表明，番木瓜环斑病毒石屏分离物（PRSV—SP）和番木瓜环斑病毒蒙自分离物（PRSV—MZ）的CP基因长873nt，编码290个氨基酸，番木瓜环斑病毒峨山分离物（PRSV—ES）、番木瓜环斑病毒版纳分离物（PRSV—BN）和番木瓜环斑病毒宾川分离物（PRSV—BC），3个分离物CP基因长867nt，编码288个氨基酸。PRSV5个分离物核苷酸序列的同源性在94％以上，氨基酸序列的同源性在96％以上。与国内外17个分离物相比，核苷酸序列同源性为89．6％～98．7％，氨基酸序列同源性为86．5％～99．6％。其中PRSV—SP和来自于越南分离物PRSV—V47无论是核苷酸序列，还是氨基酸序列同源性都达到了最高，而5个分离物与来自于巴西（PRSV—BR）、美国（PRSV—USA）、墨西哥（PRSV—Y）核苷酸序列同源性均低于90％。展开更多
文摘利用电镜和酶联免疫法在云南省采集到的5份南瓜病样中检测到番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）。为了进一步从分子水平确定云南省南瓜病毒病原种类，并为下一步转基因育种提供抗性基因，采用反转录PCR（RT—PCR）方法扩增了5个分离物的外壳蛋白（coat protein，CP）基因片段，并克隆到pGEM—T载体中。核苷酸序列测定表明，番木瓜环斑病毒石屏分离物（PRSV—SP）和番木瓜环斑病毒蒙自分离物（PRSV—MZ）的CP基因长873nt，编码290个氨基酸，番木瓜环斑病毒峨山分离物（PRSV—ES）、番木瓜环斑病毒版纳分离物（PRSV—BN）和番木瓜环斑病毒宾川分离物（PRSV—BC），3个分离物CP基因长867nt，编码288个氨基酸。PRSV5个分离物核苷酸序列的同源性在94％以上，氨基酸序列的同源性在96％以上。与国内外17个分离物相比，核苷酸序列同源性为89．6％～98．7％，氨基酸序列同源性为86．5％～99．6％。其中PRSV—SP和来自于越南分离物PRSV—V47无论是核苷酸序列，还是氨基酸序列同源性都达到了最高，而5个分离物与来自于巴西（PRSV—BR）、美国（PRSV—USA）、墨西哥（PRSV—Y）核苷酸序列同源性均低于90％。
