Avibacterium paragallinarum: an emerging birds pathogen in Qinling wildlife conservation center, China

The bacterium Avibacterium paragallinarum,previously known as Haemophilus paragallinarum,is responsible for caus-ing infectious coryza(IC)in chickens and other avian species.In this case report,an outbreak of Avibacterium paragal-linarum occurred in the Qinling area of China,resulting in clinical symptoms of facial swelling in several bird species,including Golden pheasant,Temminck's tragopan,and Peafowls,and three Golden pheasants died due to prolonged infection.Specific PCR results confrmed the presence of the pathogen in the infected birds.The report describes the clinical symptoms and pathological changes observed in the affected birds,as well as the isolation and identification of Avibacterium paragallinarum.Whole-genome sequencing and phylogenetic anal sis y were performed,and this is the frst report of inter-and intra-species transmission of infectious coryza among wild birds in China.

不同禽源副鸡禽杆菌的人工交叉致病试验

为探讨鸡源和鹅源副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum,Apg)对鸡、鹅的跨禽种感染致病力情况,试验将3株鹅源Apg和4株鸡源Apg培养物经鼻窦腔接种60日龄鸡和鹅,观察接种禽的临床症状并进行表征评分。通过组织病理学检查、细菌分离培养和Apg种特异性PCR鉴定,研究鸡源和鹅源Apg对不同宿主的致病性情况。结果显示:鸡源和鹅源Apg均可导致鸡、鹅出现典型症状与病变,且对原宿主禽种致病性高于非原宿主禽种;发病鸡、鹅的病理变化相似,以面部皮下和鼻窦黏膜水肿、充血出血、纤维素性渗出,鼻甲骨变形为特征;发病鹅和鸡组织病理变化相似,鼻窦黏膜与鼻甲黏膜出现大量炎性细胞浸润,黏膜上皮水肿、坏死、崩解脱落,固有层结构疏松,局部可见纤维结缔组织增生;3株鸡源Apg接种鸡试验组能从鼻窦部、肝脏和脾脏中重新分离到接种菌,而接种鹅试验组仅从鼻窦部分离接种菌,未能从其他组织中分离到。研究表明,鸡源和鹅源Apg均可感染鸡或鹅并引起发病,但在致病程度上以本禽源菌株强于非本禽源菌株。

副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究

[目的]探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。[方法]构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。[结果]重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和C型副鸡禽杆菌的保护率分别为0、20%和60%。[结论]本研究成功构建了原核表达载体pET-28a-lpxM,实现了lpxM重组蛋白的高效表达,且表现出良好的免疫原性。研究结果为探究副鸡禽杆菌外膜蛋白lpxM的免疫学特性以及为鸡传染性鼻炎的预防和疫苗的研发奠定了基础。

一株A型副鸡禽杆菌的分离与鉴定

对湖北省某规模化养鸡场中肿头肿脸病料进行病原菌分离,对分离菌株进行分子生物学、生化特性、血清型和耐药性鉴定,并测定了分离菌株基因组序列,通过动物回归试验验证菌株致病性。结果表明,从病料中分离出白色圆形、边缘光滑、半透明露珠样的菌落,革兰氏染色为阴性短杆菌,卫星试验中呈典型的“卫星”现象,分离菌株的16S rRNA与已报道的副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)高度同源,血清型鉴定为A型;药敏试验结果显示分离株对甲氧苄胺嘧啶、林可霉素和阿米卡星耐药,对强力霉素、大观霉素等多种抗生素敏感;动物回归试验显示,分离菌株引起雏鸡典型的肿头肿脸症状,病理切片显示菌株造成雏鸡的肺脏、肝脏以及脾脏出现明显的病变。分离株二代全基因组测序结果显示分离株有53个耐药基因和121个毒力基因。

分光光度法与活菌计数法测定副鸡禽杆菌菌液浓度的相关性研究

为建立一种快速测定副鸡禽杆菌菌液浓度的方法,本研究选取副鸡禽杆菌血清A、B和C型代表性菌株(CVCC254株、CVCC257株和CVCC256株),培养制备菌液,分别在450、540、600、650 nm波长测定其吸光度值(OD值),同时测定活菌计数值。回归分析两组数据,获取回归方程及标准曲线,分析回归方程的测定系数(R^(2))和标准曲线的点线离散度,确定最适测定波长。再选取不同培养时间点(10、12、14、16、18、20 h)的菌液,在最适波长下测定其OD值并代入回归方程获取活菌数,同时采用活菌计数法获取活菌计数值,将两组数据使用SPSS 17.0软件进行统计分析,进一步验证分光光度法与活菌计数法测定菌液浓度的相关性。结果显示,3株菌液在600 nm波长测定的OD值与活菌计数值之间均呈最佳的线性关系,确定其菌液浓度最适测定波长均为600 nm,其回归方程分别为y=14.302x-0.1441(R^(2)=0.9962)、y=14.464x-0.2746(R^(2)=0.995)和y=14.681x-0.01326(R^(2)=0.9989),y为活菌计数值(×10^(8)CFU/mL),x为OD600值。3株培养至衰退期前的菌液在600 nm波长测定的OD值代入回归方程计算获得的活菌数值与其活菌计数值无显著差异(P>0.05)。研究结果表明,衰退期前副鸡禽杆菌菌液的分光光度法与活菌计数法具有良好的相关性。因此,该分光光度法可用于快速测定衰退期前副鸡禽杆菌菌液浓度。

鹅源副鸡禽杆菌全基因组重测序及比较基因组学分析

为了分析鹅源副鸡禽杆菌(Apg)与鸡源菌株的基因组差异,对3株鹅源Apg和4株鸡源Apg进行全基因重测序及基因组分析。全基因重测序结果显示7株菌株基因组片段大小为2.567 832~2.607 127 Mb, GC含量介于40.80%~40.93%之间。SNPs同源性分析结果显示,3株鹅源菌株和鸡源C-AP3株聚集在p4chr1株的小分支上,另外3株鸡源菌株分布在其它国内菌株分支上。基因同源性分析结果显示鹅源菌株特有基因76个,鸡源菌株特有基因37个。对鹅适应性基因的筛查共聚类出79个基因,其中编码已知蛋白的基因有22个,其余编码假定蛋白;对鸡适应性基因的筛查聚类出39个基因,其中10个编码已知蛋白,29个编码假定基因。通过比较基因组学发现与Apg宿主适应性有关的基因为118个,为进一步阐释Apg跨物种感染的分子生物学机制奠定了基础。

江浙皖部分地区副鸡禽杆菌分离鉴定及生物学特性研究

为了解江浙皖地区鸡传染性鼻炎流行状况,对浙江、江苏和安徽部分地区疑似鸡传染性鼻炎的8个鸡场进行样品采集,对122份样品进行病原菌分离,对10株分离株进行形态学、卫星试验、PCR鉴定、生化鉴定和血清型鉴定等检测;利用分离株人工感染SPF鸡的动物回归试验,对攻毒后7 d和14 d的鸡只进行病理剖检和病理组织切片观察。结果表明,122份样品中副鸡禽杆菌阳性数为48个,阳性率为39.3%,8个养殖场的阳性率为36.8%~50.0%。10株副鸡禽杆菌分离菌,其中A型3株、B型4株、C型3株,致病率为60%~80%。表明不同血清型副鸡禽杆菌在江浙皖地区均有流行,具有一定的致病性,这为鸡传染性鼻炎三价疫苗研发和防控提供参考。

B型副鸡嗜血杆菌的分离鉴定

从辽宁某公司鸡场疑似鸡传染性鼻炎的病鸡眶下窦分离到一株副鸡嗜血杆菌 ,用Page程序和Kume程序对其进行血清型鉴定 ,确认为B型副鸡嗜血杆菌 ,这是首次在我国分离到B型副鸡嗜血杆菌。

副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及我国鸡传染性鼻炎的流行状况分析

从不同地区免疫失败鸡场的鸡传染性鼻炎疑似鸡体内共分离到19株细菌,经回归试验、PCR等方法鉴定为副鸡嗜血杆菌。又将分离株用血清平板凝集试验、血凝抑制试验和型特异性单抗进行了血清型的鉴定,结果表明分离菌有15株为A型,4株为B型,说明我国鸡传染性鼻炎的流行已经出现了新的特点,在疾病预防和控制中应加以注意。另外大多数鸡场的免疫失败是由于免疫效果不良所致,但也有相当一部分鸡场的免疫失败是由于B血清型的出现引起的。

三型副鸡禽杆菌对SPF鸡的致病力试验

为探讨3株A型C-Hpg 8(CVCC254)、B型(BJ-05株)和C型(668)副鸡禽杆菌对SPF鸡的致病力,用120只57日龄SPF鸡进行了此3个菌株的致病力试验,分别眶下窦内接种1.5×104cfu/0.2 mL.只-1～400×104cfu/(0.2 mL/只-1)C-Hpg 8、BJ-05株和668株,每个剂量攻击5只鸡,攻毒后观察7 d,结果除1只鸡未发病外,119只鸡均呈现典型的鸡传染性鼻炎症状。结果表明,C-Hpg 8、BJ-05株和668株副鸡禽杆菌对SPF鸡均有很强的致病力。

B型副鸡禽杆菌安徽株的分离与鉴定

2012年12月,安徽某些蛋鸡养殖场出现大量鼻炎症状的病鸡,主要表现为眼结膜发炎,眼睑肿胀、流泪,一侧或两则颜面肿胀,产蛋鸡产蛋量明显下降。为探索该病病因及制定有效防治措施,对病鸡样品进行了细菌学检验。通过细菌分离、PCR、平板凝集及血清型检测等方法,鉴定出4株副鸡禽杆菌,该分离株感染试验鸡能复制出与临床表现一致的病例。经实验室检验确认,引起该病的病原体是B型副鸡禽杆菌。

Dot-ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清型特异性抗原的研究

本研究在副鸡嗜血杆菌型特异性单克隆抗体的基础上建立了检测该菌 Ａ、 Ｃ 型特异性抗原的 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 方法，结果表明本方法在检测副鸡嗜血杆菌型特异性抗原时未呈现与其它 ８ 种常见病原体的交叉反应，新鲜肉汤的最低检出量为 Ａ 型 １３×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ｍ ｌ和 Ｃ 型 ８×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ｍ ｌ，抗原的最低检出量均为 ２５μｇ／ｍ ｌ，对 ２０ 份抗原、肉汤和卵黄样品的检测结果与其已知结果相符。这就证明本方法具有较好的敏感性和特异性，是一种能直接检测分离株血清型的良好方法。

单抗阻断ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清型特异性抗体的研究

本研究在副鸡嗜血杆菌Ａ、Ｃ型特异性单克隆抗体的基础上成功地建立了能区分Ａ、Ｃ血清型抗体的阻断ＥＬＩＳＡ诊断方法，并应用此法对９种常见病原体阳性血清及多份免疫鸡、人工感染鸡、临床可疑病鸡血清和阴性血清进行了检测，结果证明，本方法具有较好的特异性和敏感性，而且操作简便、快速，是一种适用于鸡传染性鼻炎的诊断、流行病学调查、检疫和监测的良好方法。

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定

根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列,设计合成了1对特异性引物,以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因(1 035 bp),将其克隆到pET-32a(+)载体上,构建了原核表达载体pET-HA,表达并纯化了重组蛋白,通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示,表达并纯化的HpgHA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合,并且可以凝集鸡红细胞。表明,成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体,并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg-HA融合蛋白。

副鸡禽杆菌抗原表位的筛选与鉴定

用C型副鸡禽杆菌(Apg)单克隆抗体作为靶标,筛选噬菌体展示随机12肽库,从中获得与之特异性结合的噬菌体克隆,建立了一种筛选副鸡禽杆菌表位的方法。测序结果显示,第3轮筛选后,80%的噬菌体克隆具有氨基酸共同序列Y-P-Q(A)WW,含有上述共有序列的噬菌体克隆不仅可以与靶抗体特异结合,还可与C型Apg细菌竞争结合靶抗体;将编码YSPHQWWLSGAV的DNA片段插入质粒pFliTrx的多克隆位点,转化E.coliGI826并在鞭毛成功展示;该重组菌能与靶抗体特异结合;用重组菌免疫试验鸡能产生C型Apg细菌的特异性抗体;用C型668株Apg攻毒,免疫接种鸡获得37.5%保护。提示该表位肽用于研制鸡传染性鼻炎疫苗具有广阔的应用前景。

二株副鸡嗜血杆菌分离株的生物学特性鉴定

本试验对从广西分离的 4株疑似副鸡嗜血杆菌 (H .pg) (GX_95 ,GX_97,GX_98_1,GX_98_2 )进行生物学特性研究。根据生物学特性 ,GX_97和GX_98_1被定为H .pg,GX_95和GX_98_2的生化反应特性有明显差异 ,用标准H .pg血清未能定型。交叉血凝抑制 (HI)试验显示 ,各菌株之间的交叉HI效价达 16 0 ,但各菌株与其本身的抗血清HI效价达 12 80 ,显示出很强的菌株特异性。抗菌素敏感试验也显示GX_97。

副鸡禽杆菌3个血清型参考菌株生长曲线的测定和比较

为探索副鸡禽杆菌生长特性,比较不同血清型菌株生长特性的差异,采用分光光度法和菌落计数法分别测定副鸡禽杆菌血清A型(221株)、血清B型(0222株)、血清C型(Modesto株)3个参考菌株的生长曲线,对两种方法测定的生长曲线进行比较。结果表明,两种方法绘制的生长曲线差异较大,对数生长期和稳定期菌液OD 600nm值与活菌数对数之间呈现一元二次多项式回归关系。另外,3个血清型菌株的生长稳定期都比较短暂,各型菌株达到生长高峰的时间和活菌数都有差异。该试验为副鸡禽杆菌生物学特性的比较研究及疫苗的研制奠定了基础。

B型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及生物活性鉴定

血凝素是副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum,Hpg)的主要抗原成分之一,鸡只对Hpg的免疫力与血凝素抗体滴度成正相关。根据GenBank上已发表的B型Hpg Dalian株的血凝素基因序列(AY622378),设计合成了1对特异扩增Hpg血凝素基因的引物。以大连分离株Hpg中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增出了1 038 bp的血凝素基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建了pET-HA原核表达质粒并在BL21大肠杆菌中过量表达。血凝试验显示纯化的重组蛋白具有血凝活性;Western试验证明该重组蛋白可以被B型Hpg特异性鸡血清所识别。本研究在国内首次对Hpg的血凝素基因进行克隆表达,并分析了重组蛋白的血凝活性。

鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联灭活疫苗的研究

利用Page A型、B型、C型副鸡禽杆菌和新城疫病毒La Sota株,研制鸡传染性鼻炎（三价）和新城疫二联油乳剂灭活疫苗。用3个批次疫苗进行单剂量（0.5mL/次）3次接种和大剂量（2.0mL）单次接种的安全性试验、SPF鸡的免疫效力试验、商品鸡的免疫持续期试验和疫苗的保存期试验。结果表明,3批疫苗对试验鸡安全无副作用;免疫接种SPF鸡只30d后对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥80%,用20μL/只疫苗免疫接种SPF鸡21d后新城疫的平均HI抗体〉24;商品鸡42日龄首免,110日龄二免,二免后9个月对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%,对新城疫病毒强毒100%保护;用4℃-8℃保存12个月和15个月的3批疫苗进行了SPF鸡的近期免疫效力试验,结果对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%,用20μL/只疫苗免疫SPF鸡,免疫接种后21d新城疫病毒的平均HI抗体〉2^4,对新城疫病毒强毒的攻毒保护率〉70%。说明研制的疫苗安全有效。

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。