杂合抗菌肽CecA-Mag的人工合成及其在Pichia pastoris中的分泌表达

根据抗菌肽天蚕素A（cecropinA，CA）N端第1-7个氨基酸残基，马盖宁（magainin，M）N端第2—12个氨基酸残基，以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA（1—7）-M（2—12）基因，同载体pPICZα-A连接后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168，在醇氧化酶（AOX）启动子调控下，分子量约1．9kDa的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达，抗菌特性研究表明，该表达产物具有广谱抗菌活性，对多数G菌及G^＋菌均有较好的抑菌活性。初步抑菌活性测定，显示该杂合肽对金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌有良好的抑杀活性。酸稳定实验显示pH为3．2时仍具有相当高的活性。热稳定性实验显示该杂合肽100℃加热5min后仍具有抑菌活性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mag在疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。

以甘油为碳源发酵Pichia pastoris组成型表达人血管生成抑制素

在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115(pGAP9K-AS)表达hAS的影响。结果如下:油酸(163mg/L),甘油(83mg/L),葡萄糖(76mg/L),甲醇(57mg/L)。根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115(pGAP9K-AS)工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。

基因工程菌Pichia pastoris高密度培养条件的摇瓶研究

对基因工程菌Pichiapastoris高密度培养的培养基进行了研究,选取了价廉易得的培养基,对此培养基各组分进行了优化,并对其它发酵条件进行了优化试验,得到了最优培养基配方及培养条件。结果表明,培养基最佳配方为:葡萄糖为5%,氨水单次补料量为20μL(250mL摇瓶装液量为20mL),KH2PO4浓度为0.7%,培养基其它组分为:K2HPO40.1%、MgSO4.7H2O0.03%、FeSO4.7H2O0.05%、MnSO4.H2O0.05%。种子液最佳培养时间为40h,接种量为10%,250mL三角瓶装液量为20mL,摇床转速为220r/m,发酵培养基最佳初始pH5.5,发酵温度为30℃,发酵结束时间64h。在此优化的培养基及培养条件下,菌体密度达到最高,OD600达到64.3,细胞干重20.2g/L。

大量Pichia pastoris酵母基因组DNA的提取

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最广泛的外源基因表达系统之一,提取酵母基因组是研究酵母必需的方法之一。针对常用的几种毕赤酵母基因组DNA的制备方法进行比较,并对玻璃珠法进行改进。改良的玻璃珠法不但具有省时省力、操作简便且结果稳定的优点,适合于大量DNA的提取。该方法的革新将对酵母重组子的PCR鉴定检测及表达产品DNA相关检测提供更高效稳定的保证,将成为酵母等类似微生物基因组DNA制备的首选方法。

肠道病毒71型外壳蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)扩增肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒pPIC9K/VP1,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,甲醇诱导表达。SDS PAGE分析显示:表达产物的分子量约为34kD,与天然VP1大小一致。凝胶薄层扫描分析显示:目的蛋白表达量占培养上清总蛋白的60%以上。ELISA实验表明,重组蛋白VP1具有较好的抗原性。使用饱和硫酸铵分级沉淀法初步纯化的表达产物,能够较特异性地与EV71感染者血清中的抗体产生反应,而且与抗柯萨奇病毒A16特异性抗体不产生反应。通过利用表达产物作为抗原,对156份血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的的检测用抗原。

利用Pichia pastoris生产S-腺苷甲硫氨酸的发酵工艺

在摇瓶中考察了重组Pichia pastoris发酵的诱导剂量,L-甲硫氨酸,以及pH对腺苷甲硫氨酸产量的影响。放大到3.7 L发酵罐和30 L发酵罐后,研究了重组细胞的发酵过程变化,对S-腺苷甲硫氨酸初步纯化。摇瓶中优化后的发酵条件是:每天添加1%甲醇诱导,L-甲硫氨酸为50mmol/L,培养基pH 5.0。培养144 h后SAM产量达到2.32 g/L。3.7 L发酵罐中发酵251 h后细胞浓度为120 g/L,SAM总量为15.18 g。放大到30 L发酵罐中,发酵225.5 h后细胞浓度约为120 g/L,SAM总量为145.05 g。纯化后SAM的纯度为93.5%,回收率为84.5%。

高效液相色谱法同时测定Pichia pastoris发酵过程中腺苷甲硫氨酸相关的六种物质

建立了用高效液相色谱同时测定Pichia pastoris菌体中腺苷甲硫氨酸及其代谢相关物质(AMP,腺苷,腺嘌呤,SAH)。采用Hypersil SCX色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱温是30℃,流动相是0.5 mol/L甲酸铵(用甲酸调至pH 4.0),流速为2.0 mL/min,检测波长是254 nm。结果表明该方法可以直接从细胞裂解液对六种物质进行分离和定量。该测定方法简便、可靠、准确、灵敏度高,有利于说明Pichia pastoris发酵产腺苷甲硫氨酸过程中的代谢情况。

碱性果胶酯裂解酶基因工程菌Pichia pastoris诱导表达条件初步优化

在摇瓶水平上,采用单因素试验方法,对影响碱性果胶酯基因工程菌Pichia pastoris表达的主要因素进行研究,确定初始甲醇浓度、甲醇补加量和氮源酵母氮基(YNB)浓度3个主要影响因素的初步优化结果为5%、0.8%和1.3%.在此基础上,利用响应面分析法进一步优化.经优化,表达条件为初始甲醇浓度4.35%、甲醇补加量0.75%以及YNB浓度1.31%,优化后碱性果胶酯裂解酶(PL)表达量达到40.6U/mL,较初始培养条件提高约2.3倍.同时,利用SDS-PAGE电泳对优化前后基因工程菌表达情况进行分析,结果同样表明胞外目标蛋白PL表达量有明显增加,进一步证实条件优化后对目标蛋白PL分泌表达具有十分明显的促进作用.

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展

脂肪酶作为一种常见的工业用酶,广泛应用于食品、化妆品等与生活密切相关的工业领域,但较高的生产成本和使用成本,在一定程度上限制了其进一步应用。通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达系统重组表达脂肪酶,成为解决限制脂肪酶发展的方法之一。本文介绍了脂肪酶在P.pastoris表达系统中的异源表达及其优化策略,并对毕赤酵母表面展示异源脂肪酶的技术及应用进行了归纳。

人神经生长因子的A-T克隆及在Pichia pastoris酵母中的表达(英文)

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定。方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肽的β-NGF基因序列;用A-T克隆法,与pGEM-T载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入GS115中,甲醇诱导分泌蛋白。结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SDS-PAGE电泳在14.0KD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性。结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性。

猪白细胞介素-6在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达

白细胞介素6 (Interleukin_6 ,IL_6 )是一种具有多种生物学效应的细胞因子,在疾病诊断与疫苗佐剂领域有广阔的应用前景。在本试验中,猪白细胞介素_6 (pIL_6 )的cDNA序列被克隆入甲醇酵母(Pichiapastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入P .pastorisGS115菌株。其重组菌株GS115 pPIC9K_IL6经1%甲醇诱导后,能分泌表达分子量约为2 4 5KD的重组蛋白,Westernblot确证为pIL_6。该酵母表达产物无N端糖基化修饰。用依赖IL6生长的B9细胞株检测提纯后的pIL_6 ,其生物学活性可达8×10 4 IU mg。

重组Pichia pastori高密度培养和表达过程的溶氧调控

在重组人血清白蛋白(recombinant human serum albumin,rHSA)Pichia pastori表达系统中,研究了高密度培养时细胞生长、改变碳源和诱导表达时溶氧的变化和调控规律,溶氧与细胞生长和重组蛋白表达密切相关。发酵前期的细胞生长阶段,细胞需氧降低表明碳源甘油的消耗,根据溶氧水平适时流加碳源甘油;改变碳源前,应停止流加甘油碳源,并以溶氧指标判断甘油是否消耗完全;重组蛋白诱导时流加甲醇的速度应缓慢增大,并保持细胞一定的需氧水平。高密度培养时通过流加底物速度、搅拌转速、通气量和富氧培养来关联控制发酵液溶氧水平。

CecA-Mag及其突变体在Pichia pastoris中的表达及抗菌活性试验

参考相关天蚕素类抗菌肽的作用机制及抗菌肽结构与功能关系的假说,设计了杂合肽CecA-mag的3个突变体并利用重组聚合酶链式反应定点诱变技术,使突变体得以合成,利用琼脂孔扩散法检测CecA-mag和其突变体对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等临床分离菌株的抑菌效价。结果显示,3个突变体的抑菌活性比CecA-mag分别提高了1.2、1.2、1.5倍。从而说明天蚕素类抗菌肽的作用机制与其所带电荷数有很大的关系,适当的增加其电荷数能进一步提高其抑菌活性。

草原兔尾鼠卵透明带3在Pichia pastoris酵母中的分泌表达

本研究通过酵母Pichiapastoris系统表达草原兔尾鼠卵透明带 3(lZP3)蛋白 ,获得控制害鼠生育研究的抗原物质。根据本实验室克隆获得的lZP3基因序列设计引物 ,并分别在 5’引物和 3’引物中引入了EcoRI和XbaI酶切位点。经PCR扩增 ,将lZP3克隆至穿梭质粒pSuperY上 ,获得的重组穿梭质粒pSuperY -lZP3经线性化后 ,采用电激法将重组穿梭质粒转入酵母SMD116 8菌株中 ,Zeocin+筛选阳性克隆 ,经小瓶发酵后 ,取上清作SDS -PAGE和Western -blot检测 ,结果表明lZP3在酵母中得到了成功表达 ,表达产物的分子量约为 5 5kD 。

Pichia pastoris表达β-葡萄糖苷酶基因研究

采用Pichiapastoris(毕赤酵母)表达系统表达拟南芥β-葡萄糖苷酶基因(AT5g44640),获得了有活性的目的蛋白.研究了影响β-葡萄糖苷酶基因表达的因素.结果表明,表达载体整合拷贝数、不同P.pastoris菌株、甲醇体积分数、诱导培养时间和诱导培养起始的D(600nm)等对β-葡萄糖苷酶的产量都有一定的影响.

细胞因子midkine基因的克隆及其转化甲醇酵母Pichia pastoris

目的克隆细胞因子midkine(MK)基因,并转化甲醇酵母Pichia pastoris。方法利用RT-PCR方法从人胃癌MGC803细胞总RNA中扩增MK cDNA,构建分泌表达载体pPic9k-MK,然后转入宿主菌GS115中,提取GS115的基因组DNA,用PCR法扩增鉴定阳性克隆。结果成功构建了分泌表达载体pPic9k-MK,并转入GS115中,筛选到抗4.0 mg/mlG418的重组菌株,鉴定出5个阳性克隆。结论MK基因可以转入甲醇酵母Pichia pastoris中,为今后在Pichia pastoris中表达有活性的MK蛋白,并进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了实验基础。

人hIGF-1在Pichia pastoris酵母中的分泌表达及表达产物的鉴定

根据人ＩＣＦ－１（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－１，ｈＩＧＦ－１）的天然基因序列，在尽量保存原基因序列的基础上，将一些密码子换成Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母的偏爱密码子，人工合成ｈＩＧＦ－１双链ＤＮＡ．将此合成基因整合人Ｘ－３３酵母的染色体上，用Ｚｅｏｃｉｎ＋平板筛选得到重组菌株．以胞外分泌的方式表达了ｈＩＧＦ－１蛋白，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析，得到该表达产物的相对分子质量约为７２００．

人清道夫受体AII胞外部分在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达

清道夫受体A (SR A)介导巨噬细胞无限制摄取修饰的低密度脂蛋白 (mLDL)形成泡沫细胞 ,继而形成动脉粥样硬化病灶 ,在动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用 ,被认为是治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。本文应用RT PCR方法扩增得到编码人Ⅱ型SR A胞外部分 (shSR AII)的cDNA ,将其克隆至毕赤酵母 (Pichiapastoris)分泌表达载体pPIC9K构建重组表达质粒p9K shSR AII。将重组表达质粒线性化后 ,电转化毕赤酵母GS115 ,用原位双膜法筛选获得高表达shSR AII的重组菌株GS115 p9K shSR AII。重组菌株经 1%甲醇诱导 ,SDS PAGE、Westernblot分析表明shSR AII获得了分泌表达。Ligandbindingblot结果表明表达的shSR AII具有与配基oxLDL结合的生物活性。U937泡沫细胞模型进一步表明shSR AII可通过竞争性结合oxLDL来抑制泡沫细胞的形成 ,为以shSR

Pichia pastoris发酵表达重组人复合α干扰素

在Pichia pastoris表达系统中,研究了甘油补料周期、甲醇流加策略和诱导pH对cIFN表达的影响,优化后的发酵条件是:甘油补料周期为4 h,诱导pH为5.0,基于在线甲醇检测维持甲醇浓度不超过5 g/L。培养96 h后,最大细胞干重、cIFN的表达量和生物活性分别达到168 g/L、1.24 g/L和5.4×107U/mL。

重组pichia pastoris高密度发酵表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的优化rhsTRAIL(重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)毕氏酵母工程菌在5升Braun发酵罐中的发酵表达工艺参数。方法研究培养基种类、种细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对酵母菌生长与目的蛋白表达的影响。结果在无机盐培养基中，按10％接种OD600=8-12的种菌后，24h酵母菌增殖至OD600=76；甘油含量为1％时，菌体生长速度快(OD600=160)；培养基pH值=5．0，甲醇终浓度为1％时，诱导96h表达量最高达到120mg／L。结论rhsTRAIL在毕氏酵母中发酵工艺参数为：无机盐培养基，pH值：5．0，接种10％ OD600=8-12的种菌，甘油含量1％，甲醇终浓度1％，诱导96h。