Pichia pastoris表达β-葡萄糖苷酶基因研究

采用Pichiapastoris(毕赤酵母)表达系统表达拟南芥β-葡萄糖苷酶基因(AT5g44640),获得了有活性的目的蛋白.研究了影响β-葡萄糖苷酶基因表达的因素.结果表明,表达载体整合拷贝数、不同P.pastoris菌株、甲醇体积分数、诱导培养时间和诱导培养起始的D(600nm)等对β-葡萄糖苷酶的产量都有一定的影响.

Pichia pastoris表达系统的启动子研究进展

Pichia pastoris是近年迅速发展的一种真核表达宿主,具有高效和适于进行高密度发酵等优点,已广泛应用于生产重组蛋白。启动子是表达系统重要组成部分中表达载体的核心元件,它的特性直接影响着它所调控的外源基因的表达。本文简要介绍了P.pastoris表达系统启动子pAOX1,pFLD1,pGAP,pYPT1和pICL1研究进展。

Pichia pastoris表达系统提高表达量的几个关键点

Pichia pastoris是近年来迅速发展的一种真核生物表达宿主,有着广阔的应用前景.本文从提高P.pastoris表达重组蛋白产量的角度,就启动子、高拷贝重组子、密码子偏爱、宿主菌和高密度发酵等方面的优化进行了综述.

外源基因在甲醇酵母Pichia pastoris中的表达策略

甲醇酵母 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，在其乙醇氧化酶 ＡＯＸ１基因启动子的控制下，某些外源基因（如 ＴＮＦ、ＥＧＦ等）的表达量可达克每升以上。虽然该系统是一种优良的表达系统，但有许多因素影响外源基因在其中的表达，包括外源基因的拷贝数及整合到酵母染色体的位置和方式、ｍＲＮＡ的５’和３’非翻译区（ＵＴＲ）、转录起始密码子的上下文、外源基因Ａ＋Ｔ的组成与转录和翻译的阻断、密码子的偏爱性、信号肽的特性、产物的稳定性、宿主菌的生理特性、培养基成分和培养条件等。在应用该表达系统过程中，这些因素都需加以考虑。本文将就这些因素作一概述和讨论，以有利于提高外原基因在该系统中的表达水平。

杂合抗菌肽CecA-Mag的人工合成及其在Pichia pastoris中的分泌表达

根据抗菌肽天蚕素A（cecropinA，CA）N端第1-7个氨基酸残基，马盖宁（magainin，M）N端第2—12个氨基酸残基，以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA（1—7）-M（2—12）基因，同载体pPICZα-A连接后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168，在醇氧化酶（AOX）启动子调控下，分子量约1．9kDa的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达，抗菌特性研究表明，该表达产物具有广谱抗菌活性，对多数G菌及G^＋菌均有较好的抑菌活性。初步抑菌活性测定，显示该杂合肽对金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌有良好的抑杀活性。酸稳定实验显示pH为3．2时仍具有相当高的活性。热稳定性实验显示该杂合肽100℃加热5min后仍具有抑菌活性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mag在疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。

以甘油为碳源发酵Pichia pastoris组成型表达人血管生成抑制素

在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115(pGAP9K-AS)表达hAS的影响。结果如下:油酸(163mg/L),甘油(83mg/L),葡萄糖(76mg/L),甲醇(57mg/L)。根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115(pGAP9K-AS)工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。

抗菌肽Magainin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽magainin基因片段 ,合成片段拼接后 ,与pUC19重组 ,获得magainin基因 .Magainin基因与酵母表达载体pPIC3重组 ,构建胞内表达载体pPIC3 Mag ,电击法转化GS115宿主菌 ,经表型筛选和PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .阳性克隆用甲醇诱导表达 ,用免疫印迹法确定了产物的正确性 .

碱性果胶酯裂解酶基因工程菌Pichia pastoris诱导表达条件初步优化

在摇瓶水平上,采用单因素试验方法,对影响碱性果胶酯基因工程菌Pichia pastoris表达的主要因素进行研究,确定初始甲醇浓度、甲醇补加量和氮源酵母氮基(YNB)浓度3个主要影响因素的初步优化结果为5%、0.8%和1.3%.在此基础上,利用响应面分析法进一步优化.经优化,表达条件为初始甲醇浓度4.35%、甲醇补加量0.75%以及YNB浓度1.31%,优化后碱性果胶酯裂解酶(PL)表达量达到40.6U/mL,较初始培养条件提高约2.3倍.同时,利用SDS-PAGE电泳对优化前后基因工程菌表达情况进行分析,结果同样表明胞外目标蛋白PL表达量有明显增加,进一步证实条件优化后对目标蛋白PL分泌表达具有十分明显的促进作用.

肠道病毒71型外壳蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)扩增肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒pPIC9K/VP1,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,甲醇诱导表达。SDS PAGE分析显示:表达产物的分子量约为34kD,与天然VP1大小一致。凝胶薄层扫描分析显示:目的蛋白表达量占培养上清总蛋白的60%以上。ELISA实验表明,重组蛋白VP1具有较好的抗原性。使用饱和硫酸铵分级沉淀法初步纯化的表达产物,能够较特异性地与EV71感染者血清中的抗体产生反应,而且与抗柯萨奇病毒A16特异性抗体不产生反应。通过利用表达产物作为抗原,对156份血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的的检测用抗原。

猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究

将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中 ,酶切线性化后电穿孔导入Pichiapastoris进行整合 ,经G418筛选得到高拷贝转化子 ,甲醇诱导表达。SDS PAGE和Westernblot结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P .

人神经生长因子的A-T克隆及在Pichia pastoris酵母中的表达(英文)

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定。方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肽的β-NGF基因序列;用A-T克隆法,与pGEM-T载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入GS115中,甲醇诱导分泌蛋白。结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SDS-PAGE电泳在14.0KD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性。结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展

脂肪酶作为一种常见的工业用酶,广泛应用于食品、化妆品等与生活密切相关的工业领域,但较高的生产成本和使用成本,在一定程度上限制了其进一步应用。通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达系统重组表达脂肪酶,成为解决限制脂肪酶发展的方法之一。本文介绍了脂肪酶在P.pastoris表达系统中的异源表达及其优化策略,并对毕赤酵母表面展示异源脂肪酶的技术及应用进行了归纳。

猪白细胞介素-6在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达

白细胞介素6 (Interleukin_6 ,IL_6 )是一种具有多种生物学效应的细胞因子,在疾病诊断与疫苗佐剂领域有广阔的应用前景。在本试验中,猪白细胞介素_6 (pIL_6 )的cDNA序列被克隆入甲醇酵母(Pichiapastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入P .pastorisGS115菌株。其重组菌株GS115 pPIC9K_IL6经1%甲醇诱导后,能分泌表达分子量约为2 4 5KD的重组蛋白,Westernblot确证为pIL_6。该酵母表达产物无N端糖基化修饰。用依赖IL6生长的B9细胞株检测提纯后的pIL_6 ,其生物学活性可达8×10 4 IU mg。

重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中分泌表达影响因素的研究

为获得高产稳产重组人血清白蛋白的Pichiapastoris细胞株用于高密度发酵 ,构建了多种分泌表达载体 ,在Pichiapastoris中作表达 ,研究表达载体构建等因素对表达量的影响。发现采用酿酒酵母α性成熟因子前导肽比人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽的表达量要高 10 %左右。而载体整合方式、整合拷贝数、5’非翻译区的改造和甲醇利用表型等对表达量无规律性影响。筛选到的高表达株经高密度发酵 ,细胞湿重达 46 0 g/L ,发酵液上清的人血清白蛋白含量为 1 0 g/L。

抗菌肽ABP3基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

用化学合成法合成以植物偏爱密码子编码的新抗菌肽 Ａ Ｂ Ｐ３ 基因片段，合成片段拼接后，与ｐ Ｕ Ｃ１９ 重组，经限制酶片段分析与核苷酸序列分析，获得抗菌肽 Ａ Ｂ Ｐ３ 基因。 Ａ Ｂ Ｐ３基因与表达载体ｐ Ｐ Ｉ Ｃ９ 重组，构建受乙醇氧化酶１ 基因（ Ａ Ｏ Ｘ１） 的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒，转化 Ｇ Ｓ１１５ 宿主菌，经表型筛选，阳性克隆用甲醇诱导表达，重组 Ａ Ｂ Ｐ３ 以分泌型表达，具抗菌活性，且符合 Ａ Ｂ Ｐ３

甲醇酵母Pichia pastoris高水平表达有活性的辣根过氧化物酶

表达有活性的辣根过氧化物酶（ＨＲＰ） 不仅可以深入揭示ＨＲＰ 结构与功能及其生理作用规律， 而且为ＨＲＰ的广泛需要提供新的来源． 为了在甲醇酵母Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ 中成功表达， 将编码ＨＲＰＣ成熟肽的ｃＤＮＡ 构建到ｐＰＩＣ９ 上， 再转化到Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ 中， 筛选到了分泌表达非糖基化ＨＲＰ 和高糖基化ＨＲＰ（ 分子质量超过１００ ｋｕ） 两种主要产物的重组细胞株． 优化表达条件， 目标产物在摇瓶发酵液中高效表达， 可达４～６ ｇ／Ｌ． 并且直接从发酵液中可获得具有活性的高糖基化ＨＲＰ， 每毫升发酵液中酶活力约有２ Ｕ， 经初步的纯化ＨＲＰ具有最大吸收峰４０３ ｎｍ ．

CecA-Mag及其突变体在Pichia pastoris中的表达及抗菌活性试验

参考相关天蚕素类抗菌肽的作用机制及抗菌肽结构与功能关系的假说,设计了杂合肽CecA-mag的3个突变体并利用重组聚合酶链式反应定点诱变技术,使突变体得以合成,利用琼脂孔扩散法检测CecA-mag和其突变体对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等临床分离菌株的抑菌效价。结果显示,3个突变体的抑菌活性比CecA-mag分别提高了1.2、1.2、1.5倍。从而说明天蚕素类抗菌肽的作用机制与其所带电荷数有很大的关系,适当的增加其电荷数能进一步提高其抑菌活性。

人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的 :研究人Flt 1胞外区 2 3loopcDNA在Pichia pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt 1(2 3)。方法 :采用PCR扩增Flt 1(2 3)基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母表达载体中 ,构建重组质粒pPIC9K Flt 1(2 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Muts 表型转化子 ,摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达。表达产物经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,测定其生物学活性。结果 :SDS PAGE分析显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中 ,诱导 4d的表达量达上清总蛋白的 6 0 %以上。ELISA及Westernblot实验表明 ,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,Flt 1(2 3)纯度达到 90 %以上。生物学活性检测证实其具有结合hVEGF1 6 5 的能力和抑制hVEGF1 6 5 对HUVEC的促增殖功能。结论 :获得了具有生物学活性的可溶性重组Flt 1受体胞外区 2 3loop小片段 ,为进一步的动物实验和临床应用打下了基础。

重组人载脂蛋白A-Ⅰ在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高表达

高密度脂蛋白 (High densityLipoprotein ,HDL)是血浆中重要的脂蛋白 ,其主要成分为载脂蛋白AⅠ(ApoliproteinAⅠ ,ApoAⅠ为了大量制备该蛋白 ,首先尝试利用Pichiapastoris表达系统高效表达ApoAⅠ。通过PCR扩增获得天然含人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段 ,将其插入到P .pastoris分泌型载体pPIC9K上 ,BglⅡ酶切线性化后电转化P .pastorisGS115 ,将获得的 10 0 0多个转化子依次在含不同G4 1 8浓度的YPD平板筛选高抗性转化子 ,得到的2 2个高抗性转化子经甲醇诱导 ,SDS PAGE检测得到 6株高表达菌。然后对其中的高表达菌株AP16的培养及诱导条件进行了优化 ,结果显示 :接种后培养 2 4～ 2 8h ,转入诱导阶段 ,培养基pH值在 7～ 7 5 ,菌体密度OD6 0 0 =80左右 ,以 1%甲醇诱导 96h最有利于ApoAⅠ的表达 ,表达水平达 16 0mg L。 14L发酵罐结果显示表达水平与摇瓶相当 ,均高于其它表达系统 。

前列腺特异膜抗原在Pichia pastoris酵母中的表达及鉴定

前列腺特异膜抗原是一种具有高度前列腺特异性的糖蛋白 ,其表达的增高与肿瘤的术后复发、激素抵抗及较差的预后正相关 ,在前列腺癌的诊断和治疗中有广泛的应用前景 .从前列腺癌组织提取总RNA ,利用RT PCR技术获得PSMA基因的全长序列 ,构建了重组酵母表达载体pPIC3.5K PSMA .电击法转化Pichiapastoris酵母 ,通过表型筛选和PCR鉴定证实该基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .SDS PAGE显示 ,获得的PSMA蛋白分子量约 10 0kD ,表达产物经West ern印迹证实可特异地与PSMA单克隆抗体 4G5结合 .结果表明 ,成功地获得PSMA编码的cDNA并在酵母细胞中获得表达 .