Pichia pastoris表达系统的启动子研究进展

Pichia pastoris是近年迅速发展的一种真核表达宿主,具有高效和适于进行高密度发酵等优点,已广泛应用于生产重组蛋白。启动子是表达系统重要组成部分中表达载体的核心元件,它的特性直接影响着它所调控的外源基因的表达。本文简要介绍了P.pastoris表达系统启动子pAOX1,pFLD1,pGAP,pYPT1和pICL1研究进展。

Pichia pastoris表达系统提高表达量的几个关键点

Pichia pastoris是近年来迅速发展的一种真核生物表达宿主,有着广阔的应用前景.本文从提高P.pastoris表达重组蛋白产量的角度,就启动子、高拷贝重组子、密码子偏爱、宿主菌和高密度发酵等方面的优化进行了综述.

新型酵母表达系统-Pichia.pastoris高效分泌型表达病毒生长因子的研究

目的：实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法：构建pPIC9K/VGF表达载体，扩增引物分别为P1：TATACGTAGATAGTGGTAAGG，P2：TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT；采用Pichia.pastoris酵母表达系统。结果：经酶切鉴定，证明克隆的基因是正确的；经SDS-PAGE分析，证明转化基因组中确实整合有VGF基因，其分子量为9．6kD；得到了高效分泌型VGF高产菌株，目的蛋白占培养液上清蛋白总量的80％以上，产量为0.45g/L。结论：证实可以通过Pichia.pasoris系统制备可溶性痘菌病毒生长因子。为大规模工业生产打下基础。

乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2+S基因在PichiaPastoris酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2+S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞KM71,G418筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS-PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高,表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYMEMONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg/100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2+S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。

巴斯德毕赤酵母(P pastoris)表达系统

近年来，基因工程菌被广泛用于商业化生产外源蛋白。原核生物作为基因工程表达系统简单而易培养，有其一定的优点，但也存在着一定的缺陷，如不能对表达蛋白进行糖基化等翻译后修饰，特别是对核基因的表达，可能导致产物失去生活活性。自1981年Hitzeman等首次在酿酒酵母中表达了人重组干扰素基因后，相继又有多种外源基因表达成功。与大肠杆菌不同的是，酵母可对异源蛋白进行修饰，采用有信号肽的质粒时，蛋白能被正确折叠和加工，然后分泌到培养基中；

基于GEO数据库分析筛选系统性红斑狼疮与干燥综合征共有差异表达基因及验证

目的 基于基因表达综合数据库(GEO),筛选系统性红斑狼疮(SLE)和干燥综合征(又称舍格伦综合征,SS)中共有的差异表达基因,进行功能分析并鉴定其表达水平,探索SLE和SS的潜在发病机制。方法 在GEO数据库中检索SLE和SS全血样本基因表达数据集,下载使用GSE50772,GSE81622,GSE84844和GSE48378数据集,分别筛选SLE,SS外周血细胞差异表达基因,在此基础上筛选出SLE,SS共有差异表达基因。采用基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)对差异表达基因进行功能分析。收集2024年3~4月就诊于空军军医大学第二附属医院,明确诊断为SLE和SS的患者及健康对照组外周血样本各10例,利用实时荧光定量PCR鉴定最显著的11个差异表达基因表达水平。结果 SLE和SS分别筛选出232个和110个差异表达基因,其中SLE和SS共有的差异表达基因有32个,表达水平均上调。功能分析显示,32个共有差异表达基因主要在与干扰素信号通路、对病毒的防御应答、对病毒的应答、对病毒基因组复制的负调控和免疫应答相关的生物学进程中富集。KEGG通路分析显示32个差异表达基因与病毒感染过程有关。临床样本鉴定结果显示,OAS3,IFI44,IFI44L及EPSTI1表达水平在SLE和SS患者外周血单核细胞(PBMC)中均显著升高(均P <0.05)。结论 与干扰素信号及病毒感染应答相关的生物学过程的改变在SLE和SS中均起关键作用,可能是SLE及SS的易感因素和潜在生物标志物。

乳酸乳球菌表达系统的研究进展及其应用

乳酸乳球菌是乳酸菌在异源表达蛋白方面的应用与研究中的一种重要模式菌,由于其公认的安全性、益生特性、无包涵体和内毒素、易于表面显示和细胞外分泌使其成为蛋白异源表达的理想宿主。由于乳酸乳球菌刺激黏膜免疫的特性,其在递呈病毒、细菌抗原等方面得到了广泛应用。阐述了乳酸乳球菌表达系统的相关研究进展,着重介绍了乳酸乳球菌表达异源蛋白的分泌和锚定策略,并总结了对乳酸乳球菌作为细胞工厂在食品、医药,特别是抗原呈递方面的应用,最后对乳酸乳球菌表达系统未来的研究方向进行了展望。

胰岛素原基因的高效分泌表达系统——甲醇酵母Pichia pastoris

为了提高重组人胰岛素的表达效率,使用了近年发展起来的真核表达系统-甲醇酵母Pichia pastoris. Pichia pastoris以甲醇为其惟一碳源,而乙醇氧化酶基因的启动子是强启动子,可用来调控异源蛋白的表达.该系统具有操作技术简单,可进行高水平的胞内或胞外表达,及对表达产物进行翻译后修饰与加工等显著优点.将含有小C肽或不含有C肽的人胰岛素原类似物基因整合到酵母基因组上来发酵生产人胰岛素原,在表达量上,每升发酵液中可以得到胰岛素原250～300mg,分泌水平约占总蛋白量的20%,重组人胰岛素具有与猪胰岛素相同的受体结合能力和生物活性.

外源基因在甲醇酵母Pichia pastoris中的表达策略

甲醇酵母 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，在其乙醇氧化酶 ＡＯＸ１基因启动子的控制下，某些外源基因（如 ＴＮＦ、ＥＧＦ等）的表达量可达克每升以上。虽然该系统是一种优良的表达系统，但有许多因素影响外源基因在其中的表达，包括外源基因的拷贝数及整合到酵母染色体的位置和方式、ｍＲＮＡ的５’和３’非翻译区（ＵＴＲ）、转录起始密码子的上下文、外源基因Ａ＋Ｔ的组成与转录和翻译的阻断、密码子的偏爱性、信号肽的特性、产物的稳定性、宿主菌的生理特性、培养基成分和培养条件等。在应用该表达系统过程中，这些因素都需加以考虑。本文将就这些因素作一概述和讨论，以有利于提高外原基因在该系统中的表达水平。

杂合抗菌肽CecA-Mag的人工合成及其在Pichia pastoris中的分泌表达

根据抗菌肽天蚕素A（cecropinA，CA）N端第1-7个氨基酸残基，马盖宁（magainin，M）N端第2—12个氨基酸残基，以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA（1—7）-M（2—12）基因，同载体pPICZα-A连接后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168，在醇氧化酶（AOX）启动子调控下，分子量约1．9kDa的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达，抗菌特性研究表明，该表达产物具有广谱抗菌活性，对多数G菌及G^＋菌均有较好的抑菌活性。初步抑菌活性测定，显示该杂合肽对金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌有良好的抑杀活性。酸稳定实验显示pH为3．2时仍具有相当高的活性。热稳定性实验显示该杂合肽100℃加热5min后仍具有抑菌活性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mag在疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。

以甘油为碳源发酵Pichia pastoris组成型表达人血管生成抑制素

在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115(pGAP9K-AS)表达hAS的影响。结果如下:油酸(163mg/L),甘油(83mg/L),葡萄糖(76mg/L),甲醇(57mg/L)。根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115(pGAP9K-AS)工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。

碱性果胶酯裂解酶基因工程菌Pichia pastoris诱导表达条件初步优化

在摇瓶水平上,采用单因素试验方法,对影响碱性果胶酯基因工程菌Pichia pastoris表达的主要因素进行研究,确定初始甲醇浓度、甲醇补加量和氮源酵母氮基(YNB)浓度3个主要影响因素的初步优化结果为5%、0.8%和1.3%.在此基础上,利用响应面分析法进一步优化.经优化,表达条件为初始甲醇浓度4.35%、甲醇补加量0.75%以及YNB浓度1.31%,优化后碱性果胶酯裂解酶(PL)表达量达到40.6U/mL,较初始培养条件提高约2.3倍.同时,利用SDS-PAGE电泳对优化前后基因工程菌表达情况进行分析,结果同样表明胞外目标蛋白PL表达量有明显增加,进一步证实条件优化后对目标蛋白PL分泌表达具有十分明显的促进作用.

人神经生长因子的A-T克隆及在Pichia pastoris酵母中的表达(英文)

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定。方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肽的β-NGF基因序列;用A-T克隆法,与pGEM-T载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入GS115中,甲醇诱导分泌蛋白。结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SDS-PAGE电泳在14.0KD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性。结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性。

猪白细胞介素-6在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达

白细胞介素6 (Interleukin_6 ,IL_6 )是一种具有多种生物学效应的细胞因子,在疾病诊断与疫苗佐剂领域有广阔的应用前景。在本试验中,猪白细胞介素_6 (pIL_6 )的cDNA序列被克隆入甲醇酵母(Pichiapastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入P .pastorisGS115菌株。其重组菌株GS115 pPIC9K_IL6经1%甲醇诱导后,能分泌表达分子量约为2 4 5KD的重组蛋白,Westernblot确证为pIL_6。该酵母表达产物无N端糖基化修饰。用依赖IL6生长的B9细胞株检测提纯后的pIL_6 ,其生物学活性可达8×10 4 IU mg。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展

脂肪酶作为一种常见的工业用酶,广泛应用于食品、化妆品等与生活密切相关的工业领域,但较高的生产成本和使用成本,在一定程度上限制了其进一步应用。通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达系统重组表达脂肪酶,成为解决限制脂肪酶发展的方法之一。本文介绍了脂肪酶在P.pastoris表达系统中的异源表达及其优化策略,并对毕赤酵母表面展示异源脂肪酶的技术及应用进行了归纳。

CecA-Mag及其突变体在Pichia pastoris中的表达及抗菌活性试验

参考相关天蚕素类抗菌肽的作用机制及抗菌肽结构与功能关系的假说,设计了杂合肽CecA-mag的3个突变体并利用重组聚合酶链式反应定点诱变技术,使突变体得以合成,利用琼脂孔扩散法检测CecA-mag和其突变体对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等临床分离菌株的抑菌效价。结果显示,3个突变体的抑菌活性比CecA-mag分别提高了1.2、1.2、1.5倍。从而说明天蚕素类抗菌肽的作用机制与其所带电荷数有很大的关系,适当的增加其电荷数能进一步提高其抑菌活性。

鼠卵透明带3在Pichia pastoris酵母中的分泌表达

本研究通过酵母Pichiapastoris表达鼠卵透明带 3(mZP3)蛋白 ,获得控制害鼠生育研究的抗原物质。根据国际基因库已发表的mZP3基因序列设计引物 ,并分别在 5’引物和 3’引物中引入EcoRI和XbaI酶切位点。经PCR扩增 ,将mZP3克隆至穿梭质粒pGAPZαA上 ,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA mZP3经线性化后 ,采用LiCl法转入毕赤酵母SMD1 1 68菌株中 ,Zeocin+ 筛选阳性克隆 ,酵母发酵上清液进行SDS PAGE和Western blot检测 ,结果表明mZP3在酵母中得到了特异性表达 ,表达产物的分子量约为 60kDa ,说明mZP3能够在酵母真核系统中成功表达 ,并可以用作mZP3免疫不育控制鼠害的检测抗原。

Pichia pastoris表达β-葡萄糖苷酶基因研究

采用Pichiapastoris(毕赤酵母)表达系统表达拟南芥β-葡萄糖苷酶基因(AT5g44640),获得了有活性的目的蛋白.研究了影响β-葡萄糖苷酶基因表达的因素.结果表明,表达载体整合拷贝数、不同P.pastoris菌株、甲醇体积分数、诱导培养时间和诱导培养起始的D(600nm)等对β-葡萄糖苷酶的产量都有一定的影响.