硝普钠对豚鼠耳蜗外毛细胞能动性影响的初步研究

目的 研究硝普钠 (sodiumnitroprusside,SNP)对耳蜗OHC在电压刺激下的能动性的改变情况。方法 运用全细胞膜片钳电压钳技术 ,在正常细胞内外液的条件下 ,观察不同浓度SNP对电压性刺激引起OHC能动性的影响情况。结果 在SNP浓度低于 10 0 μMol L时 ,SNP对OHC能动性的影响不明显 ,但当SNP浓度高于 10 0μMol L时 ,SNP对OHC的能动性有明显的抑制作用 ,结果有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 SNP对OHC的能动性有抑制作用 。

链霉素对豚鼠耳蜗外毛细胞钙敏感外向钾电流的影响

目的 :研究链霉素对豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜 K+ 电流的影响 ,以进一步揭示氨基甙类抗生素耳毒性的离子机制。方法 :全细胞膜片钳制技术。结果 :记录到 Ca2 + 敏感的外向 K+ 电流 [Ik(Ca) ];分别观察了 0 .1,1,10 ,10 0 ,10 0 0 μm ol/ L 链霉素对 Ca2 +敏感的外向 K+电流的影响。在指令电位 + 80 m V时 ,链霉素的抑制率分别为 0 ,(6 .72± 4.42 ) % ,(15 .5 4± 5 .43) % ,(18.0 2± 5 .32 ) % ,(30 .86± 11.2 1) %。结论 :链霉素以浓度依赖方式抑制 Ca2 +敏感的外向 K+电流 ,这可能是其急性耳毒性机制之一。

豚鼠耳蜗离体外毛细胞的膜电位和离子电流

利用膜片钳技术对分离的豚鼠耳蜗外毛细胞(OHC)进行了研究,结果表明:(1)新分离的正常OHC呈柱状,胞膜先滑,胞核位于底部,静纤毛由顶端表皮板伸出,4小时内形态无明显变化.(2)全细胞电压钳记录结合通道阻断剂实验表明,OHC膜电流主要由电压依赖性钾离子流组成.(3)利用全细胞记录方式得到的OHC静息电位值为-26±9mV((?)±SD,n=10).

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和支持细胞钾电流的影响

目的 观察KCNQ家族钾通道特异性阻滞剂利诺吡啶 (linopirdine)对豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞 (支持细胞 )总钾电流的影响 ,初步探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的分布。方法 运用膜片钳技术 ,在全细胞模式下记录正常细胞外液中 8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流 ,并观察 10 0 μmol/L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果 在正常细胞外液中 ,单离外毛细胞可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流 (theK+ currentactivatedatnegativepotential,IKn)两种钾电流 ,而单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。加入 10 0 μmol/L利诺吡啶后 ,外毛细胞中的四乙基二乙胺敏感的钾电流减小 ,IKn被完全抑制 ;而Deiters细胞中的外向整流性钾电流大小无变化。结论KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞 ,其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分 ,并构成全部的IKn;但KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Deiters细胞。

豚鼠球囊毛细胞的分离及钾离子流的研究

目的 :研究前庭毛细胞的细胞活性及膜上钾通道的类型。方法 :用酶消化后机械法分离豚鼠球囊毛细胞 ,并用全细胞膜片钳技术观察豚鼠球囊Ⅱ型毛细胞侧膜上的钾通道电流。结果 :①胶原酶Ⅳ浓度为 0 35mg/ml时 ,分离的毛细胞数量最多 ,存活时间最长 ;②当钳制电位为 - 10 0mV ,以 10mV的步距 ,从 - 70mV至 + 2 0mV阶跃 ,随着膜电位的去极化 ,可记录到一系列快速、瞬时的以A型钾通道为主的外向电流 ,4 Ap对其有特异性阻断作用。激活电压为 - 6 0～ - 5 0mV ;③当钳制电位为 - 70mV ,以 10mV的步距阶跃去极化 (- 5 0mV～ + 40mV) ,可产生一系列延迟整流性钾离子流 ,TEA能使该电流幅度下降 5 3 3 %± 6 0 %。结论 :分离豚鼠球囊毛细胞酶的最佳浓度为 0 35mg/ml,Ⅱ型毛细胞膜上有A型钾通道和延迟整流性钾通道。

硝普钠对豚鼠耳蜗外毛细胞全细胞钙电流作用的实验研究

目的 探讨一氧化氮供体———硝普钠 (sodiumnitroprusside ,SNP)对豚鼠单离耳蜗外毛细胞钙电流的影响及作用机制。方法 利用急性分离的豚鼠耳蜗外毛细胞 ,在全细胞膜片钳电压钳记录技术下 ,通过分离离子电流成分的方法 ,记录豚鼠耳蜗外毛细胞全细胞钙电流。结果 SNP对内向钙电流有抑制作用 ,在钳制电位为 -60mV ,刺激电压为 + 10mV的条件下 ,10mmol/L的SNP能抑制 (61 12± 1 99) %的内向钙电流 ( x±s ,n =5)。从 5～ 8个细胞得到的量效关系曲线中 ,其半数作用浓度为 1 9mmol/L ,最大抑制浓度为 10 0mmol/L ,斜率为 0 98。作用的机制为SNP可选择性地阻断外毛细胞膜上的L 型钙通道 (n =6)。结论 SNP作为一氧化氮的一种供体 ,能影响豚鼠耳蜗外毛细胞的生理功能 ,是通过阻断外毛细胞L

豚鼠I型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性

本文旨在探讨豚鼠I型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在，并对其相应的离子通道特性进行研究。应用全细胞膜片钳技术检测急性分离的豚鼠I型前庭毛细胞对乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）的反应。结果显示，7．5％（21／279）的I型前庭毛细胞对10-1000μmol／L ACh敏感，引发明显的外向电流。该电流对ACh的反应呈浓度依赖性，半数激活浓度（EC50）为（63.78±2．31）μmol／L，但该电流为非电压依赖性。在-50mV钳制电压和正常细胞外液中，100μmol／L ACh激活-持久缓慢的外向电流，电流幅值为（170±15）pA，该电流幅值依赖于胞外钙离子浓度，可被胞外给予的钙依赖性钾通道拮抗剂TEA阻断。I型前庭毛细胞的再次激活时间不小于1min。长时间暴露在ACh的情况下，受体离子通道不会发生自发性关闭。以上结果提示，部分豚鼠I型前庭毛细胞上存在胆碱能受体，胞外给予ACh可激活-持久缓慢的外向电流，其胆碱能受体通道对于ACh的作用呈浓度依赖性和外钙依赖性、非电压依赖性或失敏性。本研究结果对于阐明前庭传出神经的功能及其作用机制，证实并揭示I型前庭毛细胞上存在传出神经递质受体以及日后临床指导眩晕疾病的康复治疗具有重要的意义。

豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞改良分离法

目的探索一种能提供更多数量并更长时间保留豚鼠单离Ⅰ型前庭毛细胞细胞活性的分离方法。方法将耳廓反射正常的杂色豚鼠48只随机分为胶原酶Ⅳ+常用分离法组(A组)、胰蛋白酶+常用分离法组(B组)、胶原酶Ⅳ+改良分离法组(C组)和胰蛋白酶+改良分离法组(D组),每组12只,分别用0.25%胶原酶Ⅳ和0.05%胰蛋白酶结合文献报道常用液体和改良液体外加机械分离法分离豚鼠前庭Ⅰ型毛细胞,通过光镜、膜片钳、胞内钙成像等方法观察、鉴定和评价Ⅰ的活性。结果A组平均每耳分离出存活单离Ⅰ型前庭毛细胞25个,3h后存活细胞约14个,6h后存活细胞约8个,3h静息膜电位平均为-55±10mV,胞内钙离子浓度平均为105±15nmol/L;B组平均每耳分离开存活单离Ⅰ型前庭毛细胞40个,3h后存活细胞约19个,6h后存活细胞约6个,3h静息膜电位平均为-60±10mV,胞内钙离子浓度平均为95±10nmol/L;C组平均每耳分离出存活单离Ⅰ型前庭毛细胞24个,3h后存活细胞约为17个,6h后存活细胞约11个,3h静息膜电位平均为-55±10mV,胞内钙离子浓度平均为95±15nmol/L;D组平均每耳分离出Ⅰ型前庭毛细胞42个,3h后存活细胞约30个,6h后存活细胞约23个,3h静息膜电位平均为-60±10mV,胞内钙离子浓度平均为90±10nmol/L,且胞内钙离子浓度更稳定。结论与传统的胶原酶Ⅳ酶解加机械分离法相比,以胰蛋白酶酶解结合改良式液体外加机械分离技术分离方法简便易行,能提供足够量的存活时间较长的豚鼠单离Ⅰ型前庭毛细胞,适用于对细胞活性要求较高的实验如膜片钳电生理研究等。

豚鼠耳蜗外毛细胞的钾通道

目的研究外毛细胞钾离子通道的生物物理学和药理学特性。方法用细胞贴附式和内面向外式膜片钳技术,研究豚鼠耳蜗单离外毛细胞底侧膜的钾离子单通道电流。结果记录到两种钾离子单通道电流(1)大电导型钙激活钾通道,在等渗140mmol/LKC1溶液时电导为161±26pS(内面向外式)或155±27pS(细胞贴附式),反转电位为0mV;浴液为Hanks液而电极内液为140mmo/LKC1液时,电导为133±9pS(细胞贴附式)。当膜内面浴于无钙液时通道活动消失。通道呈簇状发放或快速簇状发放方式,其开启和关闭时程直方图均可用三阶指数方程拟合。双氢链霉素能够可逆性地抑制外毛细胞的大电导型钙激活钾通道,表现为电流幅度减少,在链霉素浓度增大以及细胞膜电位偏正时更明显,新霉素的抑制作用更强。(2)～44pS钾通道。结论豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜具有两种钾离子通道,研究了其大电导型钙激活钾通道的生物物理学和药理学特性。

甲基汞对豚鼠耳蜗外毛细胞外向钾电流的影响

目的:观察甲基汞对豚鼠耳蜗外毛细胞侧膜K+电流的影响,探讨甲基汞耳毒性的离子机制。方法:采用全细胞膜片钳技术分别观察汞污染度为1/1000 LD50、1/100 LD50、1/10 LD50对外毛细胞Ca2+敏感外向IK(Ca)电流的影响。结果:汞中毒后IK(Ca)幅值分别为(1.48±0.28)、(1.36±0.16)和(1.22±0.13)nA,与正常对照组相比分别下降了8%、16%和25%(P<0.05)。结论:甲基汞以浓度依赖方式抑制Ca2+敏感的外向K+电流,使IK(Ca)幅值降低,最后导致听觉机能下降。这可能是甲基汞中毒的耳毒性机制之一。

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和Deiters细胞钾电流的抑制(英文)

为探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的功能性表达,我们观察并记录了 KCNQ家族钾通道阻滞剂利诺吡啶对豚鼠耳蜗单离外毛细胞(outer hair cells,OHCs)和Deiters细胞总钾电流的影响。采用酶孵育加机械分离法分离豚鼠耳蜗单个OHCs和Deiters细胞:运用膜片钳技术,在全细胞模式下记录正常细胞外液中8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流,并观察100μmol/L和200μmol/L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果观察到,在正常细胞外液中的单离外毛细胞,可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流(the K+ current activated at negativepotential,IKn)两种钾电流,而在单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。在细胞外液中,加入100μmol/L利诺吡啶后,OHCs中的四乙基二乙胺敏感的钾电流峰电流成分被抑制,稳态电流幅值减小,且电流的失活时间常数明显延长;在细胞外液中加入100μmol/L和200μmol/L利诺吡啶后,OHCs的内向性钾电流IKn被完全抑制;而细胞外液中利诺吡啶终浓度为200μmol/L时,Deiters细胞的外向整流性钾电流幅值无明显变化。由此我们推测,KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞,其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分。

硝普钠对豚鼠单离耳蜗外毛细胞全细胞电流的影响

目的研究并探讨硝普钠(sodiumnitroprusside,SNP)对豚鼠耳蜗外毛细胞(outerhaircells,OHC)全细胞电流的影响及其作用机制。方法利用急性分离的OHC和特异性的离子通道阻断剂作为工具药,通过膜片钳电压钳记录技术观察了SNP对豚鼠耳蜗OHC全细胞电流的影响,结果①在以+40mV的指令电压刺激时,10-3mol/L的SNP抑制15.34±6.59%的细胞电流(n=5);②SNP对全细胞电流的抑制作用有电压依赖性,在刺激高于0mV时作用明显,10-2mol/L的SNP在+10mV时抑制率为4.97±1.74%,而在+40mV时的抑制率为33.82±1.61%;③SNP对全细胞电流的抑制呈量效关系,在浓度大于10-3mol/L时,抑制作用逐渐明显,10-1mol/L的SNP时接近达到最大抑制效应;④分离离子电流成分后,SNP仅对Ca2+电流有抑制作用。结论SNP对豚鼠耳蜗外毛细胞的全细胞电流的抑制作用,主要通过抑制细胞外Ca2+的内流,进而影响Ca2+依赖性K+通道而实现。

牛蛙球囊毛细胞A型钾离子流的研究

为了进一步探讨前庭毛细胞膜上钾通道的类型及动力学特征，本实验用全细胞式膜片钳技术在牛蛙球囊毛细胞侧膜上研究了钾通道电流。结果表明：（１）阻断内向电流后，当钳制电位为－１００ｍＶ，阶跃从－７０ｍＶ至＋２０ｍＶ，随着膜电位的去极化，可记录到快速、瞬时的Ａ型钾通道电流，４－Ａｐ对其有特异性阻断作用。激活电压为（－５３．８３±７．８）ｍＶ。（２）Ａ型钾通道的数量在牛蛙毛细胞间存在差异。（３）除Ａ型钾通道外，细胞膜上还含有其它类型的钾通道，这种钾通道能被ＴＥＡ阻断，其性质待定。

尼莫地平对豚鼠耳蜗外毛细胞钙电流的影响

为研究尼莫地平对豚鼠耳蜗外毛细胞钙电流的影响，应用全细胞式记录膜片钳技术，观察１８只豚鼠耳蜗分离出的２０个外毛细胞中，用全细胞方式记录到通道电流２０次。结果发现，尼莫地平可部分阻断豚鼠耳蜗外毛细胞电压依赖性钙电流，减轻毛细胞内Ｃａ２＋负荷，其阻断作用是可逆的，对电流的抑制率与尼莫地平的浓度有关，其半数抑制浓度为６０．１４ｎｍｏｌ／Ｌ，对电流的最大抑制率为３４．１６％。推测尼莫地平在治疗梅尼埃病等内耳疾病方面有应用前景。

宿主因素对毛囊重建影响的实验研究

目的:研究宿主因素对毛囊重建的影响即探讨不同种系小鼠(免疫功能缺陷及正常小鼠)作为宿主时毛发再生情况。方法:将GFP新生鼠的表皮、真皮单细胞以一定比例注射到C57和裸鼠体内。诱导形成异位毛发,并于移植后2、4、7、14、18、21 d取材进行观察,随后每隔3 d取材,直至观察到所形成毛发重新进入生长期。结果:两种小鼠体内均可形成新的毛囊,新生毛囊在诱导阶段大致相同。但C57鼠新生毛囊在18 d进入退行期,而裸鼠在21 d。C57鼠新生毛囊在33 d重新进入生长期,裸鼠则在39 d。HE切片见再生毛囊结构完整,冷冻切片荧光检测见明亮绿色荧光。细胞以不同的比例移植后发现,C57鼠体内毛囊重建效率高于裸鼠,且二者的真表皮细胞的最佳比例不同,单一细胞移植至两种鼠体内时均无毛发形成。结论:新生鼠真表皮细胞注射到不同种系小鼠体内均能形成新的毛囊,不局限于免疫功能缺陷宿主,但宿主因素对毛囊重建也会造成一定影响,所形成毛囊的周期、毛囊重建效率及形成的毛发性状不同。

应用膜片钳制技术对豚鼠耳蜗外毛细胞高电导钾通道电生理特性的研究

为了研究耳蜗外毛细胞的基本电生理特性，应用细胞膜片钳制技术对豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜的高电导的钾通道进行了初步研究。结果显示，其高电导钾通道有以下典型特征：①具有明显的电压依赖性。在膜去极化时，通道被激活，其去极化程度越高，通道活动越强。在非对称性钾浓度梯度下，其反转电位为－３０ｍＶ，斜率电导约１３３±３ｐＳ（ｎ＝５）；②通道活动能被特异性阻断剂四乙胺（ＴＥＡ）在较高浓度下（＞１０ｍｍｏｌ／Ｌ）阻断，ＴＥＡ的阻断效应呈浓度依赖性；③胞浆内钙浓度的增高，能显著激活该通道，增加其开放概率和平均开放时间。上述结果表明：豚鼠耳蜗外毛细胞存在着高电导的电压依赖的钙激活的钾通道。该研究为进一步开展通道活动的调控，以及药物等因素对通道活动影响的研究，提供了有价值的资料。

鼠尾胶原在毛细胞膜片钳实验中的应用

目的 探讨应用鼠尾胶原在豚鼠前庭毛细胞膜片钳实验中的促进毛细胞贴壁效果。方法 制作鼠尾胶原 ,观察全细胞膜片钳实验中 ,自制的鼠尾胶原对前庭毛细胞的贴壁黏附作用。结果 无鼠尾胶原时 ,前庭毛细胞悬浮于外液 ,不宜封接 ;有鼠尾胶原时 ,前庭毛细胞贴附于培养皿底壁 ,易于封接和长时间 (约 8h)的观察和记录。鼠尾胶原对前庭毛细胞具有良好的贴壁黏附促进作用。结论 鼠尾胶原能促进毛细胞贴壁 ,涂布鼠尾胶原有利于膜片钳实验的长时程记录 ;并且制作简便 。

一氧化氮对豚鼠耳蜗外毛细胞L-型钙通道电流影响的实验研究

目的观察一氧化氮(NO)供体L-精氨酸(L-Arg)对豚鼠耳蜗外毛细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响。方法以40只杂色或白色豚鼠为研究对象,采用急性酶分离方法分离豚鼠耳蜗外毛细胞,根据溶液中加入的L-Arg浓度分为0.5×10-6 mol/L组(A组)、1.0×10-6 mol/L组(B组)、1.5×10-6 mol/L组(C组),采用全细胞膜片钳技术分别记录不同浓度L-Arg组外毛细胞L-型钙通道电流。结果低浓度的NO供体L-Arg可以抑制ICa-L,此作用具有电压依赖性,对反转电位无明显影响。在指令电压0mV时,峰值电流密度增幅最大值A组为-2.12%,用药前后差异无统计学意义(P>0.05);B组增幅为-30.69%,用药前后差异有统计学意义(P<0.01);C组增幅为-65.08%,用药前后差异有统计学意义(P<0.01)。结论低浓度的NO可以抑制ICa-L。

牛蛙球囊毛细胞电压依赖性钾通道电流的研究

目的 :研究牛蛙球囊毛细胞膜上钾通道的类型。方法 :全细胞膜片钳技术。结果 :1当钳制电位为 - 1 0 0 m V,以 1 0 m V的步距阶跃 ,阶跃从 - 70 m V至 + 2 0 m V,随着膜电位的去极化 ,可记录到一系列快速、瞬时的外向电流 ,4- Ap对其有特异性阻断作用。激活电压为 - 53.85± 7.8m V。2 A型钾通道的数量在牛蛙毛细胞间存在差异。 3当钳制电位为 - 70 m V,以 1 0 m V的步距阶跃去极化 ( - 50 m V～ + 4 0 m V) ,可产生一延迟整流性钾离子流 ,四乙基氯化氨 ( TEA)能使该电流幅度下降 59%± 1 1 %。结论 :牛蛙毛细胞膜上含有 A型钾通道和延迟整流性钾通道。