pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体构建与验证

目的构建抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)与激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体,并在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中验证。方法设计特定的moesin^(T558A)、moesin^(T558D)基因突变引物,以pcDNA3/HA-moesin为模板,采用逆向PCR技术进行体外定点突变,以丙氨酸、天冬氨酸取代苏氨酸,获得抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体并测序。体外培养HUVECs,随机分为对照1组、pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组以及对照2组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组,pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组分别转染pcDNA3/HA空载体、pcDNA3/HA-moesin、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)、pcDNA3/HA-moesin^(T558D),对照1组与对照2组不予转染。转染24 h,收集细胞,采用实时荧光定量PCR法检测moesin mRNA表达,采用Western blotting法和免疫荧光法检测moesin蛋白表达。结果经测序,目的基因moesin^(T558A)、moesin^(T558D)序列完全正确,第558位苏氨酸分别突变为丙氨酸、天冬氨酸,抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体构建成功。pcDNA3/HA-moesin组moesin mRNA相对表达量显著高于对照1组和pcDNA3/HA空载体组(t分别为16.688、16.649,P均<0.05),而pcDNA3/HA空载体组与对照1组比较差异无统计学意义(t=1.925,P>0.05)。pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组moesin mRNA相对表达量均显著高于对照2组(t分别为13.809、9.260,P均<0.05),pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组与pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组比较差异无统计学意义(t=2.364,P>0.05)。Western blotting结果显示,pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组均能观察到HA-moesin蛋白表达,而对照1组未观察到HA-moesin蛋白表达。免疫荧光结果显示,pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组均能观察到HA-moesin荧光,而对照2组未观察到HA-moesin荧光。结论成功构建了抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体;经验证,这两种基因突变体均能促进moesin表达。

pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro α真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα. 方法:据GeneBank中大鼠MCP-1和GroαcDNA序列设计并合成引物,提取急性胰腺炎模型大鼠总RNA,RT-PCR 扩增,并将扩增产物TA克隆至pGEM-T easy载体,然后分别双酶切pGEM-MCP-1和pGEM-Groα回收目的片段再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+). 结果:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro α真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定,证实其构建成功. 结论:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建成功,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备急性胰腺炎pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-GroαDNA疫苗奠定了基础.

真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B的改构与应用

目的:对真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B进行改构,以简化目的基因克隆的步骤。方法:用事先设计好的2条寡核苷酸链互相退火,替换pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中NotⅠ与HindⅢ间的部分;利用改构的真核表达载体,分别构建亲环蛋白A、胆绿素还原酶B和过氧化氢酶基因的重组真核表达载体,瞬时转染293T细胞后,用His标签抗体验证其表达。结果:测序结果证实已将预想的序列替换至pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中相应位置,改构为质粒pcDNA3.1(-)reconstruct;利用改构的真核表达载体表达了相应的目的基因。结论:改构的真核表达载体pcDNA3.1(-)reconstruct可以简化融合myc和His标签的目的基因克隆的过程,并且增加了限制性位点的可选择性。

人可溶性白介素-1受体真核表达载体pcDNA3/sIL-1R的构建

目的 本研究旨在构建人可溶性白介素_1受体 (sIL_1R)真核表达载体pcDNA3 sIL_1R ,为研究骨关节病的基因治疗奠定实验基础。方法 将人sIL_1R基因的RT_PCR纯化产物及质粒pcDNA3 1(+)DNA经KpnI和XhoI双酶切、胶回收纯化酶切片段后 ,体外连接酶切片段 ,使其定向重组 ,再将重组DNA转化E .coliCompetentCellsJM10 9,经复苏后 ,在含Ampr 的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果 挑取的LB固体培养基上的 6个单菌落经酶切及测序鉴定 ,证实均为阳性克隆 ,即sIL_1R与pcDNA3 1(+)体外重组成功。结论 采用体外重组技术 ,成功地将人sIL_1RcDNA插入了真核表达载体pcDNA3 1(+)

核酸疫苗pcDNA3-γcC1诱导囊尾蚴细胞凋亡的作用

目的 :观察核酸疫苗 pc DNA3- γc C1免疫接种后动物宿主体内囊尾蚴的细胞凋亡现象 ,探讨治疗型核酸疫苗的作用机制。 方法 :分离、培养囊尾蚴混合细胞 ,用原位末端标记 (TUNEL)法分别检测免疫接种组、非接种组以及培养诱导对照组细胞凋亡情况。结果 :非接种组 ,且未经凋亡诱导的细胞核无凋亡所特有的阳性着色 ;经诱导或免疫接种组的细胞核均表现为极强的凋亡所特有的阳性着色。 结论 :首次观察到核酸疫苗接种后引起寄生生物细胞凋亡的现象 。

蛛网膜下腔注射pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经病理性痛的镇痛效应

目的:观察蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经痛的镇痛作用。方法:SD大鼠随机分为坐骨神经慢性压迫(CCI)组、CCI假手术组、实验组和空质粒组。CCI组和CCI假手术组,用于观察疼痛持续时间;实验组和空质粒组分别于CCI术后第15天蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)。测定各组注射质粒前后CCI模型鼠双后肢热痛阈(PWTL),观察纳洛酮对镇痛效应的影响,用放射免疫法检测脑脊液灌流液中脑啡肽(L-ENK)的含量,同时采用免疫组织化学方法测定两组大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体2B亚基(NR2B)表达的变化。结果:CCI术后7～33d,术侧PWTL明显低于对照侧。空质粒组注射前后热痛阈未见明显变化;与空质粒组相比,实验组大鼠蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE后的第3天产生明显的抗伤害效应(PTWL升高),持续镇痛长达18d,且镇痛效应能被纳洛酮翻转。实验组脑脊液灌流液L-ENK含量显著高于空质粒组。与空质粒组比较,实验组大鼠脊髓背角NR2B阳性蛋白表达明显受到抑制。结论:蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE能够减轻大鼠神经病理性疼痛的热痛敏行为。

日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP的安全性评价

目的评价日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP的安全性。方法同体左右侧自身对比法对3只家兔进行局部肌肉刺激实验,22只豚鼠随机分为4组:A组为无菌生理盐水阴性对照组,B组为牛血清白蛋白阳性对照组,C组为pcDNA3/SjSDISP低剂量组,D组为pcDNA3/SjSDISP高剂量组,进行全身过敏实验。结果日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP对家兔局部肌肉刺激反应轻微,对豚鼠无全身过敏反应。结论日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP在该实验条件下安全。

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的 :构建人骨形态发生蛋白 2 (humanbonemorphogeneticprotein ,hBMP 2 )真核表达载体PcDNA3 1 hBMP 2 ,转染兔骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs) ,种植去抗原牛松质骨(bovinecancellousbone ,BCB)支架体外构建组织工程骨。方法 :蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达 ,碱性磷酸酶 (ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 :转染后 ,BMSCs表达BMP 2 ,ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论 :在脂质体介导下 ,BMP 2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化 ,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好 ,为进一步应用携带BMP

小鼠骨髓树突状细胞pcDNA3-hCEA转染疫苗的抗瘤作用

目的 :将pcDNA3 -hCEA转染小鼠骨髓树突状细胞 (DCs) ,观察其诱导BALB/c小鼠对CT2 6(hCEA+ )的抗肿瘤免疫效应。方法 :采用rmGM -CSF和rmIL - 4体外诱导培养小鼠骨髓DCs;构建真核表达质粒pcDNA3 -hCEA ;并用lipofectamine将其转染DCs,制备DCs(pCDNA3 -hCEA)疫苗 ;同时制备CT2 6(hCEA+ ) ;采用RT -PCR检测DCs(pCDNA3 -hCEA)中CEAmRNA的表达 ,采用放射免疫法检测DCs(pCDNA3 -hCEA)培养上清中CEA的含量 ;使用DCs(pCDNA3 -hCEA)疫苗体外诱导小鼠同种异体T淋巴细胞靶向性杀伤。采用DCs(pcDNA3 -hCEA)疫苗预防免疫BALB/c小鼠 ,观察其对于荷临界致瘤量CT2 6(hCEA+ )小鼠的抗肿瘤效应。结果 :经G41 8筛选 ,DCs(pCDNA3 -hCEA)有 1 4 %的获得率 ;RT -PCR检测表明DCs(pCDNA3 -hCEA)内CEAmRNA呈阳性表达 ;放射免疫法检测表明DCs(pCDNA3 -hCEA)能微量表达人CEA ;DCs(pCDNA3 -hCEA)能够有效诱导CEA靶向免疫杀伤。DCs(pcDNA3 -hCEA)疫苗延长荷CT2 6(hCEA+ )瘤小鼠生存期 1周至 4周。结论 :编码肿瘤抗原基因的真核表达质粒转染的树突状细胞 。

弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅱ.pcDNA3-HBsAg-GRA1在COS-7细胞中的表达及鉴定

目的 鉴定pcDNA3 HBsAg GRA1在哺乳动物细胞内是否表达目的蛋白。 方法 提取pcDNA3 HBsAg GRA1质粒 ;体外培养COS 7细胞 ;pcDNA3 HBsAg GRA1经脂质体转染体外培养的COS 7细胞 ;取转染后的细胞培养上清进行SDS PAGE ,Western blot鉴定。结果 成功将pcDNA3 HBsAg GRA1转染入COS 7细胞。转染的细胞能高效表达分子为 4 7kD分泌性融合蛋白 (HBsAg GRA1)。HBsAg GRA1能同时被HBsAb阳性人血清及弓形虫免疫兔血清所识别。 结论 pcDNA3 HB sAg GRA1在体外培养的COS 7细胞中高效表达与预期分子量大小相同 ,且具有免疫学活性的融合蛋白。

猪囊尾蚴病重组DNA疫苗pcDNA3.1-TSO45-4B在小鼠体内的表达及诱导的细胞免疫效应

目的观察基于六钩蚴期的猪囊尾蚴病基因疫苗pcDNA3.1-TSO45-4B在小鼠体内的表达及诱导的小鼠细胞免疫应答。方法将真核重组表达质粒pcDNA3.1-TSO45-4B肌注小鼠,RT-PCR方法扩增出目的条带;ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ含量。结果RT-PCR产物为单一条带,大小为456bp,与TSO45-4B大小一致。免疫小鼠第2周细胞因子含量达到较高水平,第4周达到最高水平,第8周开始下降。结论基于猪囊尾蚴保护性抗原TSO45-4B的DNA疫苗能在小鼠体内表达并有效诱导细胞免疫效应。

日本血吸虫pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗的构建及其对家兔保护性免疫作用的研究

目的 体外扩增日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白抗原的部分基因序列 ,构建日本血吸虫pcDNA3 1(+) /MLP核酸疫苗 (SJP) ,免疫新西兰家兔 ,观察它在肌肉组织中的表达、及其对家兔的保护性免疫作用。方法 分子克隆常规操作构建SJP疫苗 ,免疫家兔 ,家兔肌肉组织体外扩增查MLP基因 ,并通过免疫组化观察重组蛋白在局部肌组织中的表达 ;做血清抗体及细胞因子分析 ,计算减虫率及减卵率。结果 经酶切、PCR及测序鉴定表明所构建的SJP中含有目的基因序列 ;免疫家兔 8周后可以在免疫家兔肌肉中检测到MLP基因 ,免疫组化结果阳性 ;可诱导IgA、IgG1及INF -γ变化 ,减虫率为2 4 10 % ,减卵率为 2 8 10 %。结论 成功地构建了含目的基因的核酸疫苗SJP ,SJP免疫家兔后 ,肌组织有重组蛋白的表达 ,并可产生一定的免疫保护性作用。

抗血吸虫DNA疫苗pcDNA3／SjHGPRT局部肌肉刺激与全身过敏实验

目的评价日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/Sj HGPRT的安全性。方法同体左右侧自身对比法对3只家兔进行局部肌肉刺激实验,22只豚鼠随机分为4组:无菌生理盐水阴性对照组、牛血清白蛋白阳性对照组、pcDNA3/Sj HGPRT低剂量组、pcDNA3/Sj HGPRT高剂量组,进行全身过敏试验。结果日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/Sj HGPRT对家兔局部肌肉刺激反应轻微,对豚鼠无全身过敏反应。结论日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/Sj HGPRT在该实验条件下安全。

pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中 ,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR ,进行酶切、PCR及测序鉴定。通过脂质体介导 ,转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,并用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达。结果 :双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR得到约 2 70 0bp含TSHR全长cD NA的片段 ,同预期片段的大小相符。所构建的pcDNA3.1/hT SHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符 ;测序结果与Gen Bank中收录的hTSHR全长序列一致 ,表明真核表达质粒构建正确。以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测表明 ,细胞可表达hTSHR。结论 :成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR ,为进一步研究TSHR的功能 ,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础。

pCDNA3-AADC真核表达载体的构建及其在原代培养骨骼肌细胞中的表达

目的 将人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）基因构建于含CMV启动子的真核表达载体pCD-NA3上,并检测其在原代培养骨骼肌细胞中的表达。方法 采用分子克隆技术将经测序证实的人神经元性AADC基因片段同真核表达载体pCDNA3连接,酶切鉴定并筛选出正向连接重组体,并采用脂质体转染法将其导入原代培养的骨骼肌细胞,免疫印记检测该基因的表达。结果 酶切证实基因片断正向连接于pCDNA3上,并在原代骨骼肌细胞中获得表达。结论 含人类神经元AADC基因的真核表达重组体可在原代培养的骨骼肌细胞中有效的表达。

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的 构建人骨形成蛋白 - 2 (h BMP- 2 )真核表达载体 pc DNA3.1- h BMP- 2 ,转染人骨髓基质干细胞(MSCs) ,探讨基因转染对其增殖和血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响。 方法 利用重组 DNA和基因克隆技术构建重组载体 pc DNA3.1- h BMP- 2 ;细胞培养和基因转染技术体外转染人 MSCs;免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测细胞 BMP- 2的表达 ;通过流式细胞仪和 VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖和 VEGF表达的影响。 结果 转染后细胞在 m RNA水平和蛋白质水平均表达 BMP- 2 ;转染后 S期细胞比例增多 ,提示细胞 DNA的合成增加 ;BMP- 2基因转染上调细胞 VEGF的表达。 结论 在脂质体介导下 ,pc DNA3.1- h BMP- 2转染 MSCs获得成功。基因转染后能促进细胞增殖并将通过使 VEGF的表达增加促进血管再生 ,为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠定了实验基础。

生长抑素pcDNA3s/SS质粒的构建与鉴定

动物生长抑制激素 (Somatostatin ,SS)基因克隆至含有乙肝表面抗原的 pcDNA3s质粒载体上 ,生长抑素基因插入到乙肝表面抗原的 5′末端 ,构建生长抑素DNA疫苗 .经PCR反应扩增出含有SS和HBsAg的融合基因片段 ,并经测序证实SS基因已成功重组到

弓形虫pcDNA3-ROP1 DNA疫苗免疫小鼠诱导体液免疫应答及保护性的初步观察

目的观察弓形虫pcDNA3-ROP1DNA疫苗免疫BALB／C小鼠诱导其体内产生的体液免疫应答及抗虫感染的免疫保护作用．方法重组质粒用生理盐水稀释后，肌注免疫BALB／C小鼠．分别于免疫后5周和10周用ELISA法测定IgG抗体滴度；免疫鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染．结果经两次检测，均可测到特异性IgG抗体，且抗体的滴度随免疫时间的延长而增高；弓形虫速殖子腹腔攻击感染免疫组小鼠的平均存活时间较对照组延长，统计学有显著性差异（P〈0．01）．结论弓形虫pcDNA3-ROP1质粒DNA疫苗能诱导BALB／C小鼠产生特异性体液免疫应答及部分抗虫免疫保护作用．

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1-polβ的构建

目的 :构建含突变型 polβ基因重组表达载体。 方法 :从食管癌标本中提取总RNA ,反转录合成cDNA ,克隆入 pCDNA3.1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒 ,并进行测序。 结果 :测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论 :成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体 ,可应用于下游研究。

壳聚糖/pcDNA-DPV-gC基因在雏鸭体内的抗原表达和分布

【目的】以DPV gC基因疫苗(pcDNA-DPV-gC)为模型,采用复凝法制备壳聚糖/pcDNA-DPV-gC纳米微球,对其在雏鸭体内的抗原表达和分布进行初步研究。【方法】将壳聚糖/pcDNA-DPV-gC基因疫苗以肌注、滴鼻和口服3种途径免疫20日龄雏鸭,于免疫后不同时间点(4h、12h、1d、3d、5d、7d、2 w、4 w、6 w和10 w)分别随机宰杀2只雏鸭,采集肝、脾、肺、肾、胰、脑、胸腺、哈氏腺、法氏囊、食道、十二指肠、盲肠和直肠,应用间接免疫组化检测DPV gC基因在雏鸭体内的抗原表达和分布。【结果】①肌注组免疫雏鸭1 d,肝脏、法氏囊、十二指肠、盲肠和直肠检测到DPV gC蛋白;滴鼻组免疫雏鸭12 h,肺脏出现阳性信号,1 d哈氏腺和法氏囊检测到DPV gC蛋白;口服组免疫雏鸭12 h,食道出现中等强度的阳性信号,1 d法氏囊、十二指肠、盲肠和直肠检测到DPV gC蛋白;②在3种免疫途径中,肝脏、肺脏、法氏囊、哈氏腺、食道、十二指肠、盲肠和直肠是DPV gC抗原表达的主要器官;阳性信号主要在肝细胞、肺上皮细胞、法氏囊和哈氏腺淋巴细胞、食道上皮细胞和肠道粘膜上皮细胞及固有层细胞等部位;③不同免疫途径免疫的壳聚糖/pcDNA-DPV-gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达量和持续时间的总体表达规律为:肌注组>滴鼻组>口服组。【结论】壳聚糖能促进DPV gC基因在雏鸭体内的表达和分布,肌肉注射是壳聚糖/pcDNA-DPV-gC基因疫苗首选的免疫方式。